评估小鼠脑组织细胞膜蛋白的棕榈酰化状态

从小鼠脑组织中提取细胞膜蛋白。

这些蛋白质在翻译后会发生修饰，即在半胱氨酸残基上连接棕榈酰基团（一种脂肪酸）。

加入还原缓冲液并在高温下孵育，以断裂非棕榈酰化半胱氨酸之间的键，使其暴露出来。

使用一种可与暴露的半胱氨酸结合的封闭试剂进行孵育，使仅有发生棕榈酰化的半胱氨酸保持反应活性。

将溶液转移后，加入氯仿、甲醇和去离子水混合，离心以沉淀蛋白质，并去除杂质。接着加入甲醇，再次离心，弃去残留的污染物。

加入缓冲液，超声处理以溶解沉淀，然后离心并去除不溶性物质。

加入裂解试剂以去除棕榈酰化半胱氨酸上的棕榈酰基团。

重复氯仿-甲醇沉淀步骤，去除任何杂质。

与未封闭的半胱氨酸结合的聚合物孵育，以帮助鉴定棕榈酰化蛋白。

重复氯仿-甲醇沉淀步骤，并去除任何未结合的聚合物。

将沉淀重悬，用于进一步分析分离蛋白的棕榈酰化状态。

首先，在55摄氏度下，将溶解的蛋白质与25微升TCEP孵育60分钟，以破坏二硫键。然后，在室温下，将溶液与12.5微升NEM储存液孵育3小时，以封闭游离的半胱氨酸。

接下来，开始进行氯仿-甲醇沉淀过程。将蛋白质溶液从1.5毫升离心管转移至可承受较低转速下摆桶转子离心的聚丙烯或玻璃管中。加入2毫升甲醇，短暂涡旋混匀。加入1毫升氯仿，再次短暂涡旋混匀。然后加入1.5毫升去离子水，再次短暂涡旋混匀。

如有必要，倒置试管以确保充分混匀。将样品在25摄氏度下以3,000 ×g离心30分钟，使用摆桶转子。小心移除并弃去试管中溶液的上层相。加入1.5毫升甲醇。通过轻轻倒置试管的方式轻柔而充分地混匀，注意避免破坏不透明的蛋白沉淀饼。

在摆桶转子中，以 3,000 ×g 和 25°C 离心样品 10 分钟。使用玻璃血清移液管，尽可能移除上清液，避免扰动蛋白沉淀层。用 1 毫升甲醇小心冲洗沉淀，然后静置晾干至少 10 分钟。

氯仿-甲醇沉淀完成后，开始裂解棕榈酰硫酯键，将蛋白质沉淀物重悬于125 µL缓冲液A中。转移至新的1.5 mL离心管中。短暂超声处理，然后在25 °C条件下以13,000 ×g或更高离心10分钟，以去除不溶性物质。

将溶解的蛋白质转移至新的1.5毫升离心管中，并加入375微升缓冲液H或缓冲液T。室温孵育样品60分钟后，重复氯仿-甲醇沉淀步骤。为将mPEG添加至未保护的半胱氨酸，首先将沉淀物重悬于含有10毫摩尔TCEP的100微升缓冲液A中。

然后将悬浮液转移至1.5毫升离心管中。加入25微升mPEG 5k储备溶液，用移液器吹打混匀。在室温下进行端对端旋转孵育。孵育60分钟后，再次通过氯仿-甲醇沉淀法去除未结合的mPEG 5k。

在大于13,000 ×g、25 °C条件下离心10分钟。小心移除上层液相，避免触及厚实的絮状沉淀层。加入1 mL甲醇，轻轻但充分混匀。在大于13,000 ×g、25 °C条件下再次离心10分钟。

小心移除上清液，并用1毫升甲醇冲洗沉淀。再次在大于13,000 ×g及25 °C条件下离心10分钟。将沉淀空气干燥后，用不含TCEP或其他还原剂的50微升缓冲液A重悬。