使用邻位连接测定法检测果蝇幼虫中的蛋白质-蛋白质相互作用

以果蝇幼虫的体壁为例，由运动神经元支配的肌肉组成，形成神经肌肉接头或 NMJ。

NMJ 的突触后肌膜含有相互作用的膜结合蛋白，这些蛋白用一抗标记。

添加邻近连接测定或 PLA，含有与单链寡核苷酸偶联的二抗的探针。孵育探针与一抗结合。

洗掉所有未结合的探针。

与含有连接寡核苷酸和连接酶的连接缓冲液一起孵育。

相互作用蛋白质的接近有助于连接器与探针结合。然后连接酶密封间隙，形成环状 DNA。

洗掉所有未绑定的连接器。

与含有聚合酶的扩增溶液一起孵育，聚合酶通过滚环扩增扩增环状DNA。

光团标记的检测器探针在溶液中与扩增的DNA退火，并在激发时产生荧光信号。

体壁安装在载玻片上，以可视化 NMJ 处荧光标记的蛋白质-蛋白质相互作用。

要开始测定，将至少200微升总体积的PLA探针抗小鼠减和PLA探针抗兔加1%BSA的1至5稀释液添加到体壁上。在37摄氏度下孵育两个小时。

使用洗涤缓冲液A洗涤体壁两次，每次5分钟后，在连接酶溶液中加入1至40稀释的连接酶。在37摄氏度下孵育一小时。

孵育后，使用洗涤缓冲液A洗涤体壁两次，每次2分钟，然后在扩增溶液中加入1至80稀释的聚合酶。在37摄氏度下孵育两个小时。

要准备用于成像的样品，请使用洗涤缓冲液 B 洗涤体壁两次，每次 10 分钟。然后使用100倍稀释的洗涤缓冲液B进行最后一次洗涤1分钟。在几滴安装液中平衡体壁至少 30 分钟。

使用细镊子，小心地将体壁转移到平台上，角质层朝下。将它们以相同的方向排列在一两滴安装液中。将 22 毫米 x 40 毫米的盖玻片放在制剂上，注意不要产生气泡。然后，使用透明指甲油密封幻灯片。