测定分离线粒体的钙保留能力

将分离自神经母细胞瘤细胞的线粒体置于含有膜不通透性钙离子结合荧光染料的缓冲液中。

孵育以使线粒体在缓冲液中稳定。

加入含钙缓冲液，并在振荡条件下孵育。

钙离子与染料分子结合，导致其产生荧光。

使用荧光光谱仪，实时监测染料的荧光。

现在，定期注入含钙缓冲液。

钙离子浓度升高会促进线粒体对钙的摄取，从而减少可与染料结合的游离钙离子，导致荧光强度下降。

当线粒体达到其最大钙储存容量后，进一步添加钙离子会触发线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。

这种孔道的开放使钙离子从线粒体释放到缓冲液中，钙离子与染料结合后导致荧光增强。

确定诱导mPTP开放所需的总钙量，该数值反映了线粒体的钙保留能力。

配制氯化钾培养基，并在实验前加入钙结合绿色荧光染料，使其终浓度为 0.5 µM。为测定线粒体钙保留能力，首先将 1 mL 含 0.5 µM 钙结合绿色荧光染料的氯化钾培养基中的分离线粒体转移至 6 孔板的每个孔中。

将线粒体与钙结合绿色荧光染料在6孔板中于室温下孵育。避光保护1分钟。孵育结束后，使用自动分配设置向6孔板的每孔中加入4微升20毫摩尔氯化钙溶液，使每毫克线粒体蛋白引入200纳摩尔钙。

使用荧光光谱仪监测荧光变化，每3秒记录一次，持续2分钟，激发波长为506纳米，发射波长为531纳米。每次读数之间由软件控制以600 RPM转速振荡3秒。再加入4微升 等分试样 向每孔加入20毫摩尔氯化钙溶液，然后每3秒监测一次荧光变化，持续2分钟。