0 次观看 • 5:13 分钟 • April 28th, 2025
取一只暗适应的、麻醉的、转基因的白眼果蝇。
果蝇的复眼光感受器中表达了带有eGFP标签的TRPL离子通道。
在黑暗条件下,TRPL 定位于感光细胞微绒毛——即小网膜的膜上。
使用压缩空气将果蝇头部朝前推入移液器吸头中。
剪去尖端,并将果蝇向后推。
再次修剪,并将果蝇向前推,直至仅头部露出。
将尖端固定在粘附于载玻片的油泥中,并将载玻片置于荧光显微镜载物台上,使眼睛朝向显微镜物镜呈径向方向。
在物镜上滴加一滴水,然后降低物镜直至接触到眼睛。
拍摄感光细胞的图像。
测量感杆、细胞体和背景的荧光强度。
用橙色光照射果蝇,以诱导TRPL向细胞体转位。
重复进行成像和荧光测量。
比较图像以观察光照后感杆小体荧光减弱,表明TRPL向细胞体转位。
在非致死性处理中准备果蝇时,将经冰麻醉的果蝇头部朝前转移至一个200微升的移液器吸头中,并用压缩空气小心地将果蝇推向吸头尖端。然后,使用解剖刀在果蝇头部前方将吸头尖端切断。再用镊子小心地将果蝇向吸头内部推进数毫米。
再次剪断移液器吸头,用压缩空气将果蝇推回吸头,使仅果蝇头部从移液器吸头中露出。将一小块黏土粘附在载玻片上后,将移液器吸头压入黏土中,使果蝇的左眼或右眼朝上。在显微镜下确保眼睛方向正确。进行图像采集时,选择水浸物镜。
对于非致死性变异,使用实验室移液器在水浸物镜的下表面附着一大滴冷卻水。将制备好的果蝇载玻片小心地放置在显微镜载物台上。然后手动降低水浸物镜,直至其接触水面,或果蝇的眼睛接触到水滴。
然后,将光路切换至显微镜相机,并生成实时图像。重新调整相机的焦距,评估眼球的方向,确保眼球沿径向朝向显微镜物镜。使用查找表软件检测是否过饱和。
对于非色素性果蝇,调整曝光时间,使每个图像中最亮的像素略低于饱和极限。拍摄图像并将其保存为原始文件,以归档记录的所有相应元数据。然后,将图像导出为点阵TIFF格式。
为了定量水浸显微照片中感杆结构内相对EGFP荧光强度,需通过点击“Analyze”调整ImageJ设置,然后选择“Set Measurements”,仅勾选“Mean gray value”选项。通过点击“File”,然后选择“Open”,导入点状TIFF图像。选取图像中一个处于焦平面的代表性区域,并通过连续按压Control和Plus键将其放大至200%到300%。
接下来,选择椭圆工具。在按住 Shift 键的同时,在图像中创建一个显著小于一个荧光小眼面的圆形选区。然后,在 ImageJ 主窗口工具栏下方查找显示的确切尺寸。要测量圆形选区内的荧光强度,请使用键盘上的箭头键将圆圈移动到第一个小眼面位置,然后单击“分析”,再单击“测量”。
将弹出一个结果窗口,列出测得的灰度值。继续测量第2至第6个小网膜,同时测量背景信号。对于无色素的果蝇,还需额外测量相应细胞体区域的信号。再测量另外两个小眼的荧光,以获得三个技术重复。使用铅笔工具标记已分析的小眼,并保存该图像以供记录。
从结果窗口中选择并复制测得的灰度值,粘贴至电子表格软件中进行进一步计算。将荧光强度值按其来源分类为小眼杆、细胞体和背景,并计算每个类别的平均强度。然后根据以下公式计算小眼杆中EGFP的相对含量:非色素眼使用第一个公式,色素眼使用第二个公式。