研究果蝇感光细胞中的膜蛋白运输

拿一只适应黑暗的、麻醉的、转基因的、白眼苍蝇。

苍蝇在眼睛的感光器中表达 eGFP 标记的 TRPL 离子通道。

在黑暗中，TRPL 定位于横纹肌的膜——感光器的微绒毛。

使用压缩空气，将苍蝇头朝下推入移液器吸头。

修剪尖端并将苍蝇向后推。

再次修剪它并向前推动苍蝇，直到只有它的头部突出。

将尖端固定在粘附在载玻片上的造型粘土中，并将其放在荧光显微镜载物台上，眼睛径向面向显微镜物镜。

向物镜中加入一滴水，然后将其降低，直到它接触到眼睛。

捕获感光器的图像。

测量横纹肌、细胞体和背景中的荧光强度。

用橙色光照亮苍蝇，诱导 TRPL 易位到细胞体。

重复成像和荧光测量。

比较图像以观察照明后横纹荧光减少，表明 TRPL 易位到细胞体。

要准备非致命变体的苍蝇，请将冰麻醉的苍蝇头朝下转移到 200 微升移液器吸头中，并用压缩空气小心地将苍蝇推向尖端。然后，使用手术刀，切掉头部前面的移液器吸头。并使用镊子小心地将苍蝇推入移液器吸头几毫米。

再次切断移液器吸头。并用压缩空气将苍蝇推回尖端，使只有苍蝇的头部从移液器尖端突出。将一块橡皮泥粘在物体载玻片上后，将移液器吸头压入其中，使左眼或右眼朝上。确保眼睛在显微镜下正确定位。对于图像采集，请选择水浸物镜。

在非致命变化的情况下，使用实验室移液器将一大滴冷冻水粘附在水浸物镜的底部。小心地将带有准备好的苍蝇的物体载玻片放在显微镜载物台上。然后，手动降低浸水物镜，直到它接触到水面，或者苍蝇的眼睛接触到水滴。

然后，将光路切换到显微镜相机，并生成实时图像。考虑到眼睛必须径向面向显微镜物镜，重新调整相机的焦点并评估眼睛的方向。使用查找表软件检测过饱和度。

对于无色素苍蝇，调整曝光时间，使最亮的像素略低于每张图像的饱和度限制。录制图像并将其保存为原始文件，以存档录制的所有相应元数据。然后，以点 TIFF 格式导出图像。

要量化水浸显微照片横纹肌中的相对 EGFP 荧光，请通过单击分析来调整 ImageJ 设置。然后，设置测量值，并仅选中平均灰度值框。通过单击"文件"导入点 TIFF 图像，然后单击"打开"。选择图像的代表性焦点区域，并通过同时反复按 Control 和 Plus 将其放大到 200% 到 300%。

接下来，选择椭圆形工具。在按 Shift 键的同时，在图像中生成一个明显小于一个荧光横纹肌的圆形选择。然后，查找 ImageJ 主窗口工具栏下方显示的确切尺寸。要测量圆形选择中的荧光强度，请使用键盘上的箭头键将圆圈移动到第一个横纹肌，然后单击分析，然后单击测量。

将弹出一个结果窗口，列出测量的灰度值。继续测量横纹肌 2 至 6，并测量背景信号。对于无色素苍蝇，对相应的细胞体区域进行额外测量。测量另外两个ommatidia的荧光，从而产生三个技术重复。使用铅笔工具标记分析的 ommatidia 并保存此图像以供记录。

从结果窗口中选择并复制测量的灰度值，并将其粘贴到电子表格软件中以进行进一步计算。根据荧光强度值的来源将荧光强度值分类到类别的横纹肌、细胞体和背景中，并计算每个类别的平均强度。然后计算横纹肌中存在的 EGFP 的相对量，使用非色素眼睛的第一个公式和色素眼睛的第二个公式。