在神经退行性蛋白过表达的酵母细胞中检测组蛋白修饰

从一株过表达与神经退行性疾病相关蛋白的酵母细胞悬液开始。

这种过表达的蛋白负责对DNA包装蛋白或组蛋白进行化学基团修饰。

加入氢氧化钠和β-巯基乙醇，然后在冰上孵育。

氢氧化钠和β-巯基乙醇裂解细胞，释放细胞内蛋白，包括组蛋白。

离心裂解液以收集蛋白质。弃去上清液。

向蛋白质沉淀物中加入上样染料，并加热以使其变性。

将这些变性蛋白质和蛋白质标记物加入凝胶中，并进行电泳以按分子大小分离。

将蛋白质电转至膜上，洗涤后加入封闭缓冲液以防止非特异性结合。

加入可特异性结合修饰组蛋白的一抗。

洗涤以去除未结合的抗体，然后与荧光标记的二抗孵育，后者可结合于一抗。

明显的荧光条带证实了组蛋白修饰，表明神经退行性相关蛋白的过表达。

为进行蛋白质印迹分析而裂解细胞时，先将酵母菌细胞沉淀物在冰上融化，然后用 100 微升蒸馏水重悬。向每个细胞样品中加入 300 微升 0.2 摩尔的氢氧化钠和 20 微升 2-巯基乙醇，并通过移液重悬沉淀物。

冰上孵育10分钟后，通过离心收集细胞，并将样品重悬于100 µL上样缓冲液中。随后在加热块上煮沸样品10分钟。在样品裂解的同时，将两块凝胶放入凝胶架中，内槽加运行缓冲液至满，外槽加至双凝胶线标记处。

样品准备好后，将15 µL细胞裂解液分别加入10孔12%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中，并在蛋白Marker孔中加入5 µL蛋白ladder。以150 V电压电泳约45分钟，或直至加样染料前沿迁移至凝胶底部。

在凝胶电泳进行的同时，每块凝胶用转移缓冲液浸泡两块纤维垫，并用甲醇浸泡一张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。当凝胶完成后，用转移缓冲液冲洗膜和缓冲液。然后将一块预先浸泡过的纤维垫放置在半干式转膜装置细胞的底部，接着依次放置PVDF膜、凝胶以及第二块预先浸泡过的纤维垫。

然后将电流调至150毫安，持续1小时。蛋白转膜结束后，从转膜装置中取出膜，用蒸馏水短暂漂洗。将漂洗后的膜蛋白质面朝上放入小型染色盒中，加入Tris缓冲盐水（TBS）封闭缓冲液，室温下轻轻振荡孵育1小时。

封闭孵育结束后，在 TBS 中于 4 摄氏度下用抗酵母组蛋白及其特异性修饰抗体以及适当的核内参抗体，将膜过夜孵育。

次日早晨，用含0.1%吐温-20的TBS缓冲液在室温下摇动洗涤膜4次，每次5分钟。最后一次洗涤后，在室温下用适当的二抗孵育印迹1小时，随后用TBST缓冲液摇动洗涤4次，每次5分钟，最后再用TBS缓冲液单独摇动洗涤一次，时间为5分钟。

然后在荧光 Western 印迹成像系统上成像 2 分钟。