利用ELISA检测神经退行性疾病相关蛋白α-突触核蛋白

从一只过表达突变型α-synuclein的转基因小鼠的脑组织开始，该蛋白是一种与神经退行性疾病相关的错误折叠神经元蛋白，组织浸没在高盐缓冲液中。

使用大研杵匀浆组织，随后换用小研杵进一步破碎组织，以释放细胞内蛋白，包括α-突触核蛋白。

将匀浆转移至离心管中并进行离心。收集含有蛋白质的上清液，并用缓冲液稀释。

将此上清液加入已预先用封闭剂处理过的、包被α-突触核蛋白特异性抗体的微孔板中，以防止非特异性结合。

在振荡条件下孵育，使正常和突变的α-突触核蛋白结合。

洗涤平板，然后加入针对突变型α-突触核蛋白的检测抗体，并在振荡条件下孵育。

再次洗涤后加入酶标抗体，随后在振荡条件下孵育。

加入底物，在避光条件下振荡孵育。底物与酶反应产生颜色变化。

用酸终止反应，并测定吸光度以定量突变型α-突触核蛋白。

制备脑匀浆时，向分离的脑区加入适量的HS缓冲液，以达到下表所示的预期匀浆百分比。使用由硼硅酸盐玻璃管和两个研磨杵A与B组成的组织研磨器，将待破碎的脑区放入玻璃管中，然后用研磨杵A上下研磨10次，使组织充分解离。

然后，换用研杵B再均质20次。用移液管将匀浆液转移至1.5毫升离心管中，并对剩余的脑组织样本重复上述均质步骤。在4°C条件下，以1,000 ×g离心5分钟，收集上清液，并将其分装为每份200微升的等分试样。

用100微升抗体包被液包被96孔微孔板的孔，于4摄氏度孵育过夜。次日，向各孔中加入300微升PBST，使用板洗机洗涤5次。此后在室温下操作，每孔加入200微升T20 PBS封闭缓冲液，于150转/分钟振荡1小时，然后用PBST洗涤5次。

使用 PBST 将脑匀浆用 1% BSA 按照此处列出的指南进行稀释，并向每孔加入 100 微升。然后在室温下以 150 RPM 振荡孵育两小时，随后用 PBST 洗涤板子五次。

最后一次洗涤后，加入文本方案中表二所列的α-突触核蛋白检测抗体，用PBST和1% BSA稀释。室温下以150 RPM振荡孵育一小时，然后按前述方法洗涤平板五次。

接下来，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或抗兔IgG抗体用含1% BSA的PBST按1:8,000比例稀释后加入孔中，150 rpm振荡孵育1小时，随后洗涤5次。然后每孔加入100微升TMB显色液，于避光条件下150 rpm振荡孵育15分钟。每孔加入100微升1摩尔盐酸终止反应。最后使用酶标仪在450纳米波长处测定吸光度。