人脑组织中分离的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS/MS分析

从尸检人脑组织中分离的神经黑色素颗粒（NMGs）来源的肽段开始。

多巴胺能神经元中的神经黑色素颗粒（NMGs）含有神经黑色素色素、蛋白质和脂质。

取一根高效液相色谱（HPLC）柱，其内填充有以疏水配体修饰的硅胶基质固定相。

将肽上样到色谱柱中。

疏水性肽与色谱柱的结合力强于亲水性肽。

将洗脱缓冲液通过层析柱。

疏水性较弱的肽段先洗脱，而疏水性较强的肽段后洗脱。

洗脱的肽段进入质谱仪的电喷雾电离源，在此被电离为带电的肽离子。

随后，离子化的肽段进入质谱分析器，根据其质荷比进行分离。

选择的肽离子被导入碰撞池并碎裂成较小的离子，其质荷比再次被测定。

最后，将数据与参考数据库进行比对，以鉴定NMG样品中存在的蛋白质。

按照文中所述进行胰蛋白酶消化后，将200至400纳克的样品肽溶解于惰性质谱玻璃进样瓶中一定体积的0.1%三氟乙酸（TFA）溶液中，以制备HPLC-MS分析样品。若因样品量过少而无法测定浓度，可通过比较总离子流来确认上样量一致。

开始进行蛋白质组学原始数据分析时，点击“加载”以将原始文件导入软件中。点击“设置实验”以指定样本名称。为定义组别特异性参数，在“可变修饰”中添加脱酰胺化（NQ）、氧化（M）和氨基甲酰化（N端）修饰。然后将半胱氨酸的氨基甲酰化（C）设为固定修饰。在消化选项卡中选择胰蛋白酶作为消化酶。

在无标记定量（LFQ）标签页中，添加 LFQ 选项。如果需要处理的文件超过 10 个，请选择快速 LFQ 选项以缩短处理时间。确保所有其他组别特定参数保持出厂设置，然后转到全局参数标签页，在序列标签页中添加从 uniprot.org 获取的 FASTA 文件。相应地修改标识符规则，并添加智人（Homo sapiens）的分类学 ID 9606。

进行蛋白质定量时，选择唯一肽段和 razor 肽段。然后，在无标记定量选项卡中添加 iBAQ 选项作为蛋白质定量的度量方法。确保所有其他全局参数保持出厂设置，然后点击“开始”。分析成功完成后，获取蛋白质组的 .txt 输出文件。