使用人突触体对小胶质细胞样细胞进行活细胞吞噬作用测定

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与核染色剂一起孵育以标记细胞核。

在阴性对照孔中添加肌动蛋白聚合抑制剂。

在孵育过程中，抑制剂与肌动蛋白丝结合，抑制肌动蛋白聚合和吞噬作用。

将板保持在低温下，并添加pH敏感染料标记的人突触体--神经突触末端的分离片段。

在低温下离心板以促进细胞-突触体相互作用，但防止过早摄取。

将板转移到活细胞成像系统。

在测试孔中，突触体被吞噬并与溶酶体融合形成吞噬溶酶体。溶酶体酸性环境激活染料，导致其发出荧光。

随着时间的推移，在测试孔中，更多的突触体被吞没，导致荧光进一步增加。

然而，在阴性对照孔中，肌动蛋白聚合受到抑制，阻止突触体摄取。由此产生的最小荧光证实了荧光对肌动蛋白介导的吞噬作用的依赖性。

在测定当天，每孔去除 40 微升培养基，并加入 10 微升核染色液。将板孵育两个小时。在冰上解冻标记的突触体，并使用水超声仪轻轻超声处理一分钟。再次，立即将突触体放在冰上。以每 50 微升培养基 1 微升突触体稀释标记的突触体和 IMG 完全培养基。

对于阴性对照，在IMG完全培养基中制备60微摩尔细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合，从而吞噬作用。然后，向每个孔中加入 10 微升该溶液，最终浓度为 10 微摩尔，并孵育 30 分钟。从培养箱中取出板，在10摄氏度下孵育10分钟。将板保持在冰上并加入 50 微升含有突触体的培养基。

将板在10摄氏度下以270倍g离心三分钟，并将板保持在冰上直至成像采集。将板插入活细胞成像读数器中，然后选择要分析的孔。然后，选择 20 倍物镜。接下来，调整焦点发光二极管或 LED 强度积分时间以及明场和蓝色通道的增益。突触体荧光在初始时间点应可以忽略不计。

选择每个孔在蒙太奇中获取的单个图块数。在井中心获取 16 个图块，对总井面积的约 5% 进行成像。将温度设置为 37 摄氏度和所需的成像时间间隔。