0 次观看 • 3:28 分钟 • April 28th, 2025
取一个含具有吞噬活性的小胶质样细胞的多孔板。
使用细胞核染料孵育以标记细胞核。
向阴性对照孔中加入肌动蛋白聚合抑制剂。
孵育期间，抑制剂与肌动蛋白丝结合，抑制肌动蛋白聚合和吞噬作用。
将培养板保持在低温条件下，并加入pH敏感性染料标记的人类突触体——分离自神经突触末梢的片段。
在低温条件下离心培养板，以促进细胞与突触体的相互作用，同时防止过早被摄取。
将培养板转移至活细胞成像系统。
在检测孔中，突触体被吞噬后与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体。溶酶体的酸性环境激活染料，使其产生荧光。
随着时间推移，检测孔中的突触体被进一步吞噬，导致荧光信号进一步增强。
然而，在阴性对照孔中，肌动蛋白聚合受到抑制，从而阻止了突触体的摄取。由此产生的微弱荧光证实了荧光信号依赖于肌动蛋白介导的吞噬作用。
在检测当天，每孔移除 40 微升培养基，并加入 10 微升核染色溶液。将培养板孵育两小时。将标记的突触体置于冰上解冻，并使用水浴超声仪轻柔超声处理一分钟。随后立即将突触体放回冰上。用 IMG 完全培养基稀释标记的突触体，每 50 微升培养基中加入 1 微升突触体。
作为阴性对照，用IMG完全培养基配制60微摩尔的细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。然后，向每孔加入10微升该溶液，使终浓度为10微摩尔，孵育30分钟。将培养板从孵育箱中取出，在10摄氏度下孵育10分钟。保持培养板置于冰上，并加入50微升含有突触体的培养基。
将培养板在10摄氏度下以270 × g离心3分钟，并在成像采集前将培养板保持在冰上。将培养板插入活细胞成像仪中，选择待分析的孔，然后选择20倍物镜。接着，调节明场和蓝色通道的聚焦发光二极管（LED）强度、积分时间及增益。在初始时间点，突触体荧光信号应可忽略不计。
选择在每个孔中采集的拼接图像的单个图块数量。在孔的中心区域采集16个图块，成像面积约占孔总面积的5%。将温度设置为37摄氏度，并设定所需的成像时间间隔。