通过蛋白质印迹法检测磷酸化神经元钾-氯共转运蛋白2

取含有钾-氯共转运蛋白2（KCC2蛋白）的细胞裂解液，该蛋白可调节神经元内的氯离子水平。

在调控位点上的磷酸化会破坏KCC2功能，从而调节神经元活性。

将裂解液加入与靶向磷酸化KCC2的抗体偶联的磁珠中。孵育以使结合发生，随后洗涤以去除未结合的蛋白质和细胞碎片。

用变性缓冲液在高温下处理以释放 KCC2，然后离心以分离磁珠。

将含有KCC2的上清液加样到电泳凝胶中，通过蛋白分离成条带以确认磷酸化KCC2的存在。

将条带转移至膜上，然后在封闭液中孵育，以封闭非特异性结合位点。

用靶向磷酸化KCC2的一抗进行孵育。

洗涤，然后与酶标记的二抗孵育，以标记一抗。

再次洗涤，然后加入化学发光底物，该底物将与酶反应产生光信号。

测量光强度以定量裂解液中磷酸化的KCC2。

用移液器将300 µL蛋白G Sepharose加入微量离心管中。然后在500 ×g下离心2分钟。弃去上清液后，加入500 µL PBS，充分涡旋混匀。离心后弃去上清液，并重复此步骤。

接下来，将1毫克抗KCC2苏氨酸906和抗KCC2苏氨酸1007抗体与200微升蛋白G Sepharose珠混合，再用PBS定容至500微升。在4摄氏度下于振荡平台或旋转轮上摇动两小时后，用PBS重复洗涤两次。

对细胞裂解液进行蛋白质定量，取1毫克细胞裂解液加入已洗涤的磁珠中，在末端旋转仪中孵育后离心。用含150毫摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液洗涤三次，再用200微升磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后将沉淀重悬于100微升LDS上样缓冲液中。

将试管在室温下于旋转摇床中振荡5分钟。随后放入加热块中孵育，并进行离心，取上清液用于上样。组装蛋白质印迹凝胶制备装置，倒入新配制的8%分离胶以制胶，留出约2厘米空间至制胶玻璃板顶端。向装置中加入200微升无水异丙醇，室温静置60分钟。

用移液器吸除异丙醇，并用约 200 微升蒸馏水小心冲洗凝胶。在灌胶装置中加入新配制的 6% 浓缩胶后，轻轻插入梳子，室温静置 30 分钟。然后将制好的凝胶固定到电泳槽中。

将电泳缓冲液倒入电泳槽后，在第一孔中加入 5 微升分子量标准品，并在其余每孔中加入等量的蛋白质样品。用 LDS 填充空孔，在 120 伏电压下电泳约 90 至 120 分钟。用含有 20% 甲醇的转移缓冲液重新水化硝酸纤维素膜。

用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，并将其轻轻铺在准备好的叠层上。按以下顺序组装待转移的“三明治”结构：负极、夹心泡沫、滤纸、已冲洗的SDS-PAGE凝胶、已冲洗的硝酸纤维素膜、滤纸、夹心泡沫、正极。组装完成后，将“三明治”放入转移槽中，以90伏电压运行90分钟，或以30伏电压运行360分钟。

使用封闭缓冲液在室温下封闭干燥的膜 1 小时。将膜与适当稀释的一抗和 beta actin 溶液在封闭缓冲液中于室温孵育 1 小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜。随后用 TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

将洗涤后的膜与用封闭缓冲液稀释的二抗在室温下孵育60分钟，随后重复三次TBST洗涤。完成后，将洗涤后的膜置于成像板上。为显影信号，先在膜上均匀铺加等体积混合的两种增强型化学发光试剂所配制的溶液，然后将成像板转移至成像系统进行成像。