烧灼诱导眼内高压后视网膜神经节细胞胞体的定量分析

0 次观看3:06 分钟 • April 28th, 2025

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取一只大鼠眼睛中分离出的经化学固定的视网膜。

眼睛表现出热损伤导致的角膜缘血管丛损害,角膜缘血管丛是围绕角膜的一组血管网络。

这种损伤会阻碍房水引流,导致眼内压(IOP)升高,并引起视网膜神经节细胞(RGC)变性。

用通透化溶液处理视网膜,以通透细胞膜和核膜。

加入封闭液以防止非特异性抗体结合。

移除封闭液。

加入靶向主要在视网膜神经节细胞(RGCs)中表达的转录因子的一抗。

洗涤以去除未结合的抗体。

加入与一抗结合的荧光素标记的二抗。

洗涤以去除未结合的抗体。

使用DNA结合染料对细胞核进行复染。

用适当的封片剂将视网膜清洗后封固在玻璃载片上。

在落射荧光显微镜下观察视网膜。

与对照组相比,受损眼睛中细胞密度降低,证实了因眼内压升高导致的视网膜神经节细胞变性。

分离视网膜后,将其转移至含有1毫升PBS的24孔培养板中,保持内层视网膜朝上。用PBS稀释的0.5%非离子型表面活性剂洗涤组织,以实现通透化处理。然后,在室温下轻轻振荡孵育组织1小时,使用封闭液进行封闭。在孵育期间,配制BRM 3A一抗溶液,并于4摄氏度保存。

组织包埋后,将视网膜置于 200 µL 一抗溶液中,在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育 72 小时。随后用 PBS 洗涤组织。再将组织置于 200 µL 二抗溶液中,室温孵育 2 小时,然后加入核复染溶液孵育 10 分钟,以实现荧光核染色。

用 PBS 洗涤三次后,使用两把小刷子将视网膜转移至玻璃载玻片上,保持玻璃体面朝上。将视网膜的背侧象限朝上放置于载玻片上。最后,在玻璃盖玻片上加入 200 µL 抗荧光淬灭封片剂,然后将其覆盖在平铺的视网膜样本上,用于显微镜分析。在共聚焦落射荧光显微镜下,使用 40 倍物镜观察平铺样本,以估算视网膜神经节细胞数量。

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最后更新:22 八月 2026