一种用于定量检测表达胰岛素的集落形成前体细胞的实验方法

本视频演示了一种生成三维培养物的实验流程，该流程可使类似胰腺的前体细胞分化为表达胰岛素的细胞集落。首先，从一条神经源性蛋白三重EGFP基因敲入小鼠胚胎干细胞系中获得已分化的细胞，将其解离后根据EGFP表达情况进行分选，以富集类似内分泌谱系的前体细胞。将EGFP阳性分选后的单细胞接种至含有Matrigel和生长因子的半固体培养基中进行培养。

这限制了单个前体细胞的移动，同时允许其在体外存活、增殖和分化。随后，在显微镜下对具有独特形态的克隆集落数量进行计数和评分，以计算在特定分选细胞群体中形成集落的前体细胞频率。通过实时PCR和免疫荧光显微镜对单个集落进行分析，结果显示，由ngn3阳性细胞衍生的集落表达胰岛素，而ngn3阴性细胞衍生的集落则不表达胰岛素。

与现有的悬浮培养胰腺类球体等技术相比，该技术的主要优势在于能够同时检测更大量细胞的内在前体细胞集落形成能力。该方法有助于回答有关胰腺干细胞和前体细胞生物学的问题，例如前体细胞表达哪些标志物，以及哪些内在或外在因素对于这些细胞的自我更新和分化维持至关重要。该技术的应用前景可延伸至1型糖尿病的治疗：若能鉴定出胰腺前体细胞并将其诱导分化为类似β细胞的细胞，则这些细胞可用于替代终末期1型糖尿病患者中受损的β细胞。

该方法还可应用于其他系统，例如研究胰腺在出生后及成体阶段、骨髓、肝脏和脾脏中形成集落的前体细胞。通常，初次接触该技术的研究者会遇到困难，因为将细胞解离为单细胞悬液，以及在分装前对Matrigel和甲基纤维素的处理均具有挑战性。当我意识到尚无克隆形成实验可用于解析胰腺前体细胞与其分化后代之间的谱系关系时，首次提出了该方法的设计思路。

这种集落实验在过去对研究造血干细胞和祖细胞起到了重要作用。我认识到，研究胰腺干细胞生物学也需要类似的实验方法。该方法的可视化演示至关重要，因为半固体培养基成分本身具有黏性，其制备和分装步骤较难掌握。

演示该实验操作的人员包括：硕士研究生 Michael Winkler 先生、技术员 Nancy 女士，以及来自实验室的博士后研究员 Lang Jing 博士。本实验旨在制备后续克隆形成实验所需的条件培养基。将神经元 ES 细胞在体外诱导分化为类似胰腺的细胞。首先，在光学显微镜下观察培养六天的胚胎体。

至少30%至40%的类胚体直径应达到150微米以上。较大的类胚体应含有深色斑点，提示分化程度增强。将80至100个类胚体转移至六孔无黏附培养板的每个孔中，然后轻轻晃动培养板，使类胚体聚集于各孔中央，以增加细胞间的接触。

这些接触有助于类胚体向胰腺样细胞的更好发育。将培养板轻轻放回培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养。A 13。

更换为含有烟酰胺（nicotinamide）浓度提高四倍以及人重组活性βB因子的新鲜贴壁培养基，以诱导内分泌细胞分化。随后将培养物放回培养箱继续培养。第16天，收集培养基，并通过0.2微米聚醚砜膜过滤，以去除所有细胞碎片。

从此时起，收集的培养基将被称为条件培养基，将条件培养基分装至15毫升圆锥形聚丙烯管中，并于-80摄氏度保存，直至使用前。Neurog3是一种在胰腺内分泌前体细胞发育过程中表达的转录因子。表达Neurog3的内分泌前体细胞最终分化为胰腺α、β、δ、ε细胞以及表达胰多肽的细胞。为了便于鉴定表达NGN3的细胞，我们在一种基因敲入小鼠胚胎干细胞系中，将NGN3基因座的一个等位基因替换为EGFP报告基因。由此获得的细胞系被命名为NGN3-EGFP，用于获取分化后的NGN3-EGFP阳性细胞和NGN3-EGFP阴性细胞。

第16天，首先用胰蛋白酶将细胞从培养板上解离，以获得单细胞悬液。将细胞团块与胶原酶B和DNase I共同孵育，并通过40或70微米的筛网过滤。随后加入DPI，并使用流式细胞分选仪对细胞进行分选，以区分前向散射与侧向散射，前者反映细胞大小，后者反映细胞颗粒度，两者均被绘制于图中。

随后绘制门控以去除非细胞碎片。使用DPI区分死细胞，死细胞将呈阳性染色。在405至413纳米波长激发，并用454/40滤光片检测发射光，同时对脉冲宽度进行门控，电子前向散射脉冲的宽度可揭示双联体，这些双联体应在通过EGFP通道FL1与自发荧光的荧光激活细胞分选门控之前予以去除。

使用对照亲本细胞系（如左图所示的TL细胞系）的第16天细胞，可观察到真实的荧光信号，从而能够观察到右图所示的NGN3-EGFP阳性细胞群体。如图中箭头所示，为减少分选过程中NGN3-EGFP阴性细胞的污染，特意将NGN3-EGFP阳性细胞的分选门向右侧移动。确定分选门后，分别分选NGN3-EGFP阳性细胞和NGN3-EGFP阴性细胞，并置于冰上保存，待后续铺板使用。

实验前一晚将基质胶置于4°C冰上。实验当天，将以下试剂或溶液置于冰上：D-M-E-M-F 12、甲基纤维素条件培养基、FCS、烟酰胺、XTEND、VEGF A以及重组人活性in beta B。使用前至少半小时，将一盒无菌的200微升移液器吸头置于-20°C。在准备接种分选细胞之前，必须先将半固体培养基组分加入一个5毫升聚苯乙烯管中。首先，使用16.5号针头将少量3.3%甲基纤维素溶液吸入注射器中。

然后立即推出溶液以排出空气。这将用溶液填充注射器中的死腔，便于准确测量半固体溶液的体积。接着避免产生气泡，吸取并转移预定体积的甲基纤维素溶液至一个5毫升离心管中。

加入含有FCS、烟酰胺、对βB具有活性的条件培养基，以及VEGF A和D-M-E-M-F 12。然后使用预冷的枪头加入Matrigel。最后，将所需数量的分选细胞加入5毫升离心管中。

始终最后加入细胞，以避免细胞过早被激活。然后 tightly 盖紧管盖，用手剧烈而充分地振荡试管。由于振荡会产生气泡，将试管置于冰上静置五分钟，或直至微小气泡浮出消失。

使用带有18.5号针头的1毫升注射器吸取少量半固体培养基细胞混合物，立即排出注射器中的空气。然后缓慢将500 µL半固体细胞混合物直接注入24孔低吸附培养板每个孔的中心位置。每个样本需设置四复孔，仅使用水平放置的24孔板中最内侧的四列孔进行培养。

在其余孔中加入无菌水，以促进含细胞培养物的加湿。铺板后立即在光学显微镜下观察细胞。

单个细胞被随机且均匀地分布于各孔中。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳空气中孵育8至12天。孵育8至12天后，再次在显微镜下观察细胞。

这是培养物中基质胶（matrigel）分布均匀的一个良好示例。以下是基质胶（matri gel）分布不均导致形成阿帕奇（Apache）框架结构的实例。在基质胶缺失的区域，细胞克隆无法生长。

这是未向半固体培养基混合物中添加基质胶（matri gel）时孔板背景的一个示例。为计数形成的克隆，可在培养板下方附上一个网格。然后使用 10 倍物镜观察并计数克隆；由于培养基具有三维特性，克隆将出现在不同的焦平面上。

因此，在光镜观察过程中，可能需要对每个克隆进行焦距调整。此处展示的是培养8至12天后，在半固体培养基中表达胰岛素的克隆的代表性显微照片；箭头所指示的克隆呈随机分布，表现为小而深色、无光泽反射的团块，直径约为60至100微米。随后对单个手工挑选的克隆进行微流控R-T-P-C-R分析，结果显示胰岛素2和胰高血糖素的表达，与我们此前的报道一致。这些结果表明，单个NGN3 EGFP阳性细胞能够分化为同时含有两种胰岛激素的克隆，类似于原始的第一波样内分泌细胞。通过整体荧光染色进一步证实了C肽（de novo胰岛素生成的标志物）的蛋白表达。

综上所述，当按照本报告所示方法进行胰岛素表达集落形成单位检测时，可轻松确定具有形成集落能力的单个前体细胞数量，如本文及我们先前报告所示，可通过体外分离源自小鼠胚胎干细胞的NGN3 EGFP阳性细胞（而非ngn3 EGFP阴性细胞）来富集表达胰岛素的集落形成单位。一旦掌握该技术，可在分选后1至3小时内完成操作。在进行该操作时，需注意务必将细胞完全解离为单细胞悬液，并将所有培养组分置于冰上，以防止Matrigel凝固，同时应最后加入细胞至离心管中，以避免细胞过早被激活。在完成该操作后，还可采用其他方法（如单细胞操作）进一步探究额外问题，例如单个细胞是否足以启动集落形成。

该技术将为胰腺干细胞和前体细胞生物学领域的研究人员开辟新的途径，使他们能够探索这些细胞的自我更新能力以及向类似β细胞分化的潜能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对表达胰岛素的集落形成前体细胞进行定量集落形成实验。