神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

将神经球细胞置于含有去垢剂、钙离子和蛋白酶抑制剂的缓冲液中。

去垢剂可使细胞通透化，同时抑制剂可灭活蛋白酶，以保护染色质结合的目标蛋白。

加入核酸酶并进行孵育。核酸酶利用钙离子消化染色质。

加入含EDTA的缓冲液，以螯合钙离子，使核酸酶失活。

加入裂解缓冲液以裂解细胞，释放染色质。

离心并收集上清液。

加入针对目标蛋白的特异性抗体，旋转孵育。离心并移除上清液。

加入靶向抗体的磁珠，并在旋转条件下孵育。

加入裂解缓冲液以分离非特异性结合的 DNA。

用磁力捕获磁珠并移除上清液。

加入高盐缓冲液以分离非特异性结合的蛋白质。

用磁力架捕获磁珠，并移除上清液。

加入稳定缓冲液，磁力捕获磁珠，并去除污染物。

用蛋白酶K缓冲液重悬，以消化蛋白质，释放DNA。

收获神经球后，每项免疫沉淀使用 1 × 10⁶ 个神经球细胞，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。离心后弃去上清液，将神经球沉淀重悬于 1 毫升平衡盐溶液中。将悬液转移至低蛋白结合的 1.5 毫升微量离心管中，然后按前述条件再次离心。

接下来，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 95 µL 消化缓冲液中，每 1×10⁶ 个细胞加入 1:100 稀释的蛋白酶抑制剂混合物。立即用移液器反复吹打细胞以防止结块，并避免产生气泡。然后将 5 µL 0.1× 微球菌核酸酶与 145 µL 消化缓冲液混合，并按每 1×10⁶ 个细胞加入 5 µL 稀释后的微球菌核酸酶。轻轻弹动离心管混匀，随后将管子置于 37 °C 金属浴中，准确孵育 12 分钟。

使用微球菌核酸酶消化来片段化染色质是最关键的步骤。适当的染色质片段化对于实现ChIP的高分辨率至关重要。为确保该步骤成功，应依次孵育多个样品，以避免过度消化的发生。

12 分钟后，每 1×10⁶ 个细胞加入 10 µL 的 10× 微球菌核酸酶终止缓冲液。从此步骤开始，样品必须始终保持在冰上。微球菌核酸酶消化样品的生物分析仪分析结果显示，大部分 DNA 已被切割成单核小体、二核小体和三核小体。接下来，每 1×10⁶ 个细胞加入 110 µL 含蛋白酶抑制剂混合物（1:100 稀释）的 2× RIPA 缓冲液。

轻轻振荡试管混匀，然后在 4 摄氏度、1,700 × g 条件下离心 15 分钟。将含有染色质的上清液转移至普通的 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。使用添加了蛋白酶抑制剂（1:1,000）的 RIPA 缓冲液稀释染色质，使每次免疫沉淀（IP）的体积为 100 至 200 微升。随后取出相当于 ChIP 体积 10% 的等分试样作为输入样本。

通过加入100 µL含有蛋白酶K的TE缓冲液制备输入样品，并在55 °C下孵育1小时。使用PCR纯化试剂盒纯化输入样品后，用微量分光光度计测定其浓度。将结果记录在实验记录本中。对每个样品将要进行的每次免疫沉淀（IP），加入10 µL经洗涤的蛋白A和G磁珠，在4 °C、20 RPM转速下旋转孵育1小时。

将样品置于磁力架上，静置使磁珠分离。随后将所需体积转移至新的 1.5 毫升离心管中。向每管中加入目标抗体，再用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。4 摄氏度旋转孵育过夜，转速同前。次日，以 2000 ×g 离心 10 秒。然后向每次免疫沉淀（IP）中加入 10 微升磁珠，4 摄氏度、20 RPM 旋转孵育 3 小时。

然后将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸去上清液。随后向每次免疫沉淀（IP）中加入150 µL含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，在4 °C、20 RPM条件下孵育5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸去上清液。然后向每次免疫沉淀（IP）中加入150 µL低浓度蛋白酶抑制剂的氯化锂缓冲液，在4 °C条件下以20 RPM旋转孵育5分钟。

孵育结束后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。然后用移液器吸除上清液。向磁珠中加入150 µL不含蛋白酶抑制剂的冷TE缓冲液，在4 °C、20 RPM转速下旋转孵育5分钟。完成最后一次洗涤步骤后，将样品重悬于100 µL TE缓冲液中，加入蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，在55 °C孵育1小时。