凝胶包埋的患者来源病变纤维血管组织的免疫荧光染色

取复水的纤维蛋白凝胶包埋、固定并通透化的患者来源病变纤维血管组织。该组织含有结构不规则的新生血管结构，包括内皮细胞和周细胞。

用封闭液处理组织，以防止非特异性抗体结合。

用靶向内皮细胞和周细胞表面蛋白的一抗进行孵育。

用缓冲液冲洗以去除未结合的抗体，然后在缓冲液中孵育。

缓冲液洗涤后，加入荧光染料标记的二抗，使其与一抗结合。

用缓冲液洗涤以去除过量抗体，并在缓冲液中孵育。

缓冲液洗涤后，加入细胞核染料以染色细胞核。用缓冲液和去离子水冲洗，去除未结合的染料。

将组织转移至显微镜载玻片上。

加入封片剂，并用含有快速固化封片剂的盖玻片封片。

空气干燥后，将载玻片置于低温条件下保存。随后在落射荧光显微镜下对组织成像，以观察新生血管结构中内皮细胞与周细胞的空间分布。

将培养板倾斜放置于支撑物上，在室温下用 500 µL 封闭液孵育液滴 2 小时。根据文本方案配制一抗混合液。

然后使用圆头刮勺将液滴转移至圆底96孔板中。每孔加入30 µL一抗混合液，4 °C孵育过夜。次日，将液滴转移至12孔板中，每孔含2 mL洗涤液。用三次5分钟的洗涤步骤冲洗液滴，随后再进行九次每次30分钟的洗涤。

次日，用 PBS 将液滴冲洗三次。根据文本方案配制相应的荧光素标记二抗混合液。将液滴转移至圆底 96 孔板，方法如前所述。然后在避光条件下，于室温用 30 µL 二抗混合液孵育 4 小时。

4小时后，将液滴转移至含有洗涤液的12孔板中，每孔加入2毫升洗涤液。首先用三次5分钟的洗涤步骤冲洗液滴，然后进行四次30分钟的洗涤步骤。

第二天，用洗涤液冲洗液滴5次，每次30分钟，再用PBS冲洗3次，每次30分钟。再过一天，将液滴转移至圆底96孔板中，操作方法如前所述。在室温下用Hoechst核染色剂对液滴进行复染，持续30分钟。将液滴转移至含有2毫升PBS的12孔板中，每孔加2毫升PBS。然后用PBS冲洗3次。

接下来，沿方形盖玻片的边缘涂抹一层薄而快干的封片介质，并静置干燥一分钟。然后将液滴浸入含有去离子水的12孔板的孔中进行冲洗，再将该液滴转移至显微镜载玻片上。

接下来，将15 µL非硬化型抗荧光淬灭封片剂滴加到液滴上。将盖玻片轻轻覆盖在液滴上，使封片剂面向载玻片。静置使其自然沉降。

将载玻片在室温下干燥两小时，并于4摄氏度条件下过夜保存。最后，使用配备光学切片功能的直立式落射荧光显微镜，以20倍或40倍物镜对载玻片进行成像。