小鼠脑切片荧光原位杂交后神经元的免疫染色

取含有神经元的小鼠固定且通透的脑切片，包括表达胆碱乙酰转移酶的胆碱能神经元。

对切片进行荧光原位杂交，以检测定位于胆碱能轴突上的靶mRNA，利用荧光探针实现信号扩增，并通过荧光显微镜检测信号。

加入含有蛋白质和淬灭剂的封闭溶液。蛋白质可防止非特异性结合，淬灭剂可中和残留的固定剂。

使用靶向神经元乙酰胆碱转移酶的一抗进行孵育。

用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。

孵育与胆碱乙酰转移酶结合的初级抗体相对应的荧光素标记的二抗。

用缓冲液洗涤以去除过量的抗体，然后用蒸馏水冲洗以除去缓冲液残留物。

使用含核染料的封片剂对切片进行封片，以标记细胞核。

使用荧光显微镜对切片进行成像，以观察目标 mRNA 信号以及经特异性抗体标记的胆碱能轴突。

每个切片上加入100至200微升封闭液，封闭液含3毫克/毫升BSA、100毫摩尔/升甘氨酸和0.25% Triton X-100的PBS溶液。用封口膜覆盖每张载玻片，在室温下孵育30分钟。

孵育后，向载玻片中加入100至200微升用封闭液稀释的抗体，此处使用抗胆碱乙酰转移酶抗体。用封口膜覆盖载玻片后，在4°C条件下孵育两天。确保脑切片不会干燥。若需要，可在孵育24小时后重新向脑切片添加抗chAT抗体溶液。

将载玻片在室温下用1×PBS洗涤三次，每次五分钟，然后向载玻片上加入100至200微升相应的Alexa荧光标记二抗。用封口膜覆盖，于室温避光孵育一小时。

一小时后，将载玻片用1×PBS洗涤三次，每次五分钟，方法同前，然后用蒸馏水洗涤一次。用含DAPI的封片剂封片，随后在荧光显微镜下观察脑切片。