视网膜突触处神经递质受体的高分辨率成像

取一只小鼠的视网膜切片置于透射电镜载网上。该切片中含有视网膜神经节细胞（RGCs），这些细胞通过突触与双极细胞相连。

突触前双极细胞含有排列在突触膜附近带状结构中的神经递质囊泡。

突触后RGC的细胞膜上呈现成簇分布的神经递质受体。这些细胞用霍乱毒素B亚基（cholera toxin subunit B，CTB）进行标记。

用缓冲液洗涤以维持 pH。

用封闭缓冲液孵育，以封闭非特异性结合位点。

用靶向神经递质受体和CTB的一抗进行孵育。

用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体并维持 pH。

使用不同大小的金纳米颗粒偶联的二抗进行孵育，二抗与一抗结合，从而标记目标分子。

去除未结合的抗体，然后将样品风干。

应用可结合大分子的重金属，以增强对比度。

利用电子显微镜，通过标记的CTB识别RGCs，并定位标记的神经递质受体。

此步骤中，使用超薄切片机切取70纳米厚的超薄切片，并将其收集到经Formvar-碳支持膜覆盖的镍网上。先用蒸馏水洗涤镍网一次，随后用TBS洗涤三次。然后将镍网置于20微升含5% BSA的TBS溶液中孵育30分钟，接着置于20微升含有山羊抗CTB抗体和一种NMDAR亚基抗体的混合液中，于室温下过夜孵育。

随后，每次用 20 微升 pH 7.6 的 TBS 将载网洗涤三次。接着，用 pH 8.2 的 TBS 将载网洗涤一次，持续五分钟。然后将载网与 20 微升混合液在室温下孵育两小时，该混合液包含与 10 纳米金颗粒偶联的驴抗兔 IgG 以及与 18 纳米金颗粒偶联的驴抗山羊 IgG。

孵育两小时后，用 20 微升 pH 7.6 的 TBS 将载网清洗三次，每次清洗后用超纯水冲洗一次，然后将载网自然晾干。随后，在避光条件下，先用 5% 醋酸铀在蒸馏水中染色八分钟，再用 0.3% 柠檬酸铅在蒸馏水中染色五分钟。