重组细胞中气味受体激活的实时监测

从含有贴壁生长的重组哺乳动物细胞的多孔板开始，孔中加入含荧光素（一种发光底物）的刺激溶液。

孵育以使荧光素进入细胞。

这些细胞表达与嗅觉G蛋白及受体转运蛋白偶联的膜结合型气味受体。

此外，这些细胞表达对环磷酸腺苷（cyclic AMP）敏感的胞质Glosensor蛋白，即一种发光蛋白。

在孔板之间的空间中加入可挥发的气味剂溶液，并将孔板置于已用相同气味剂预平衡的化学发光仪中。

开始进行发光检测。

气味分子与细胞的气味受体结合，激活偶联的G蛋白，并使其α亚基（Gα）解离。

解离的 Gα 亚基结合到膜嵌入的腺苷酸环化酶上并将其激活。活化的酶将 ATP 转化为 cAMP。

这些环磷酸腺苷与Glosensor蛋白结合，改变其构象，从而促进荧光素的结合。

这种相互作用产生发光现象，证实了气味受体的激活。

加入75微升cAMP试剂溶液。移除孔中的刺激溶液，并向每孔加入25微升稀释的cAMP试剂溶液。将96孔板在室温、避光且无气味的环境中孵育两小时。

首先，将气味物质苯乙酮用10毫升矿物油稀释至1%，并盖紧管盖。在cAMP试剂孵育结束前，向一个新的96孔板的每孔中加入25微升该气味溶液。然后将此含气味物质的孔板放入发光检测仪腔室内，平衡5分钟，使挥发性气味分子充分扩散至腔室中。设置发光检测仪在20个循环中连续记录发光信号，每个循环的检测时间为90秒，循环间间隔0.7秒，且无延迟时间。

在读板前立即从孵育 chamber 中取出气味剂板。在含有转染细胞的 96 孔板中，于孔与孔之间的空隙加入 25 微升气味剂，并迅速将板放回 chamber 内。在 30 分钟内启动对所有孔的发光检测，共检测 20 个循环。