0 次观看 • 4:15 分钟 • April 28th, 2025
取一个含有大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）单层培养物的腔室载玻片，以模拟血脑屏障的内皮细胞层。
细胞因缺氧缺糖后复氧造成的应激，表现出紧密连接蛋白和肌动蛋白应力纤维的破坏。
移除培养基并洗涤细胞，加入固定剂以保存细胞结构，然后洗去多余的固定剂。
使用去垢剂处理，以通透细胞膜。
使用封闭剂孵育，以封闭非特异性结合位点。
为了标记紧密连接蛋白，先与特异性一抗孵育，然后去除未结合的抗体。
使用荧光染料标记的二抗孵育，以标记一抗。
或者，为了标记应力纤维，可加入荧光标记的鬼笔环肽。
洗涤以去除未结合的标记分子。
移除腔室，加入含荧光DNA结合染料的封片剂以染色细胞核，然后加盖盖玻片封固。
使用共聚焦显微镜观察荧光标记的紧密连接蛋白和应力纤维。
将每孔 RBMEC 单层细胞暴露于 100 至 200 微升 Opti-MEM 低血清培养基中，继续孵育 1 小时。随后用 PBS 洗涤腔室载玻片三次，每次每孔使用 100 至 200 微升 PBS。用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。然后同前法用 PBS 洗涤细胞三次。
现在，向每个孔中加入100至200微升含0.5% Triton X-100的PBS溶液，以对细胞进行通透处理。室温孵育15分钟。细胞通透处理完成后，加入封闭液，并在室温下作用1小时。
接下来，对 ZO-1 蛋白进行免疫荧光染色，或对 F-actin 进行标记。若对细胞中的 ZO-1 进行免疫荧光染色，需在 4 摄氏度条件下与一抗共同孵育过夜。次日，用 PBS 洗涤细胞三次，例如在去除固定剂时的操作。随后，在室温下将细胞与 100 至 200 微升 FITC 标记的抗兔二抗孵育一小时，以实现用罗丹明鬼笔环肽对细胞进行标记。
加入封闭液孵育一小时后，将细胞暴露于100至200微升罗丹明-鬼笔环肽溶液中，用含2% BSA的PBS按1:50稀释，孵育20分钟。在二抗或罗丹明-鬼笔环肽孵育后，再次用PBS洗涤细胞三次，方法同前。随后通过剥离弹性膜去除腔室。接着进行封片操作，使用含抗荧 quench 试剂和DAPI的封片介质。使用60倍物镜通过共聚焦显微镜在单一层面上对细胞成像。