大鼠冠状组织冰冻切片的小胶质细胞与神经元免疫组织化学染色

取一张载有固定且透化的鼠冠状组织冷冻切片的玻片。

使用疏水性笔划出区域，以创建受控的染色环境。

将切片转移至湿盒中，以防止后续步骤中试剂和组织干燥。

用血清蛋白处理切片，以阻断非特异性结合位点。

用缓冲液冲洗以去除多余的血清蛋白。

用针对小胶质细胞和神经元上特定蛋白的一抗进行孵育。

用缓冲液洗涤以去除未结合的一抗。

与结合一抗的荧光染料标记的二抗共同孵育。

用缓冲液洗涤以去除未结合的二抗，然后用双蒸水冲洗。

加入水性封片剂以保护荧光信号，盖上盖玻片并封固。

在荧光显微镜下观察切片，以可视化免疫标记的小胶质细胞和神经元。

用纸巾擦干玻片边缘，并用疏水笔在玻片边缘画出疏水圈，以确保液体均匀覆盖并减少边缘效应。接下来，向每张玻片加入 300 µL 含血清的 PBS 溶液进行封闭。该血清应与二抗的宿主物种一致。本实验中使用了驴血清。

确保封闭液延伸至切片边缘并完全覆盖组织，以避免染色不均。将切片放入湿盒中，在室温下孵育一小时。孵育期间，准备一抗溶液：将IBA1抗体按1:5,000稀释，pan neuronal抗体按1:500稀释，稀释液为含1%驴血清的PBS溶液。

移除封闭液，加入300 µL抗体溶液，其中包含两种目标抗体。将所有玻片置于湿盒中，在4°C下孵育过夜。次日早晨，用PBS洗涤玻片三次，每次五分钟。

在含1%驴血清的PBS中，将两种荧光二抗按1:250稀释，配制荧光二抗混合液。每张载玻片上加300 µL混合液，并将载玻片置于避光、密闭的湿盒中，室温孵育60分钟。随后用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。最后用双蒸水冲洗载玻片。在PBS洗涤过程中需避光保护载玻片。

向每张载玻片上滴加几滴水溶性封片剂，以帮助保持荧光信号强度。然后盖上盖玻片，并使用棉签去除残留的气泡。为将封片剂密封在载玻片上并防止组织切片干燥，可用指甲油涂抹边缘进行封固。将载玻片置于避光盒中，水平静置干燥一小时，随后包裹铝箔，存放在4摄氏度的避光密闭容器中。