Name: CD4 + T淋巴细胞艾滋病毒的捕获使用一次性微流体芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 了解如何使用一次性微流控芯片从患者血液中捕获CD4阳性T淋巴细胞。该方法采用PDMS材料制备精密装置，可在资源有限环境下实现T辅助淋巴细胞的高效定量分析。

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<ol>
<li>制备具有抗 CD4+ 生物素化表面的微流控通道。</li>
<li>使用注射泵以 5 ml/min 的流速向微流控通道中注入 10 ml 样本血液。</li>
<li>以 20 ml/min 的流速用 PBS 冲洗血液，持续 20 分钟。</li>
<li>以 5 µl/min 的流速注入稀释后的 FACS 裂解液（用 PBS 将原液稀释至 10%），持续 15 分钟。</li>
<li>孵育 15 分钟。</li>
<li>以 5 ml/min 的流速注入初级 CD3+ 抗体溶液（用 PBS 将原液稀释至 10%），持续 20 分钟。</li>
<li>孵育 2 小时。</li>
<li>以 5 ml/min 的流速用 PBS 冲洗通道，持续 15 分钟。</li>
<li>同时以 5 ml/min 的流速注入 20% AF488 CD4+ 抗体、0.2% DAPI 原液以及 10% 二抗 CD3+ 抗体，持续 20 分钟。</li>
<li>孵育 20 分钟。</li>
<li>以 5 ml/min 的流速用 PBS 冲洗通道，持续 15 分钟。</li>
<li>在荧光显微镜下计数细胞：<ol>
<li>白光（光学）— 黑白图像：细胞和灰尘</li>
<li>紫外光（DAPI）— 蓝色：仅细胞</li>
<li>蓝光（CD4+）— 绿色：T 淋巴细胞和单核细胞</li>
<li>绿光（CD3+）— 红色：仅 T 淋巴细胞</li>
</ol></li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PDMS 微通道</td><td></td><td></td><td></td><td>由SU-8模具制备</td></tr><tr><td>血液</td><td></td><td></td><td></td><td>来自正常人类受试者的献血。麻省总医院，10倍高密度白细胞或布莱根妇女医院&amp;rsquo;医院</td></tr><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x 达尔伯克&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液。</td></tr><tr><td>FACS 溶血溶液</td><td></td><td>BD 生物科学</td><td>349202</td><td>用PBS将储备液稀释至10%。</td></tr><tr><td>抗CD4+生物素标记抗体</td><td></td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>IM0704</td><td>用PBS/BSA将储存液稀释10倍制备表面，其中储存液由0.2 mg储存品与1 ml去离子水混合后，再与生物素标记的抗CD4+抗体混合而成。 </td></tr><tr><td>山羊抗人CD3δ</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>用 PBS 将原液稀释至 10%</td></tr><tr><td>兔抗山羊IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>二抗（抗CD3抗体），用PBS将储备液稀释至10%</td></tr><tr><td>抗人 CD4+</td><td></td><td>BD 生物科学</td><td>557695</td><td>Alexa Fluor 488 标记，用 PBS 将储备液稀释至 20% </td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐溶液，用PBS稀释至0.2%（由原液稀释）</td></tr></tbody></table>

使用一次性微流控芯片捕获cd4+ t淋巴细胞用于hiv研究

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

使用一次性微流控芯片捕获CD4+ T淋巴细胞用于HIV研究

您好，我叫Richard Lin，是哈佛大学与麻省理工学院健康科学与技术部TI Mercy教授团队的一名研究人员。我正在开展的项目是定量并捕获患者血液中的CD4阳性与CD3阳性T淋巴细胞，该技术将应用于资源有限的医疗环境。如图所示，我面前有一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微填充装置。该装置的通道本身高为50微米，总体积为10微升。这是一个极为精密的装置，我们将用它来捕获辅助性T淋巴细胞。基本上，这是针对 HIV 患者的诊断基准。微流控装置的表面已预先固定了蛋白质和 CD4 阳性抗体，注射器中目前装有 pH 为 7.4 的 PBS 生物缓冲液。接下来，我们将把缓冲液注入通道，以冲洗掉未结合的 CD4 阳性抗体。在此阶段，流速无需控制，因为我们只是要冲洗掉多余的物质，流速的具体数值并不重要。此处将是装置的入口，而这里则是出口，即我的左侧、你们的右侧。现在我将冲洗掉多余的抗体溶液，如果仔细观察出口处，可以看到液体正在流出，虽然量非常少，但仔细看可以发现空气和液体正通过管路从通道中流出。现在我们已经冲洗掉了多余的抗体溶液，接下来可以准备注入血液。现在我将拔下入口处的管路，打开一支新的注射器来装血液，即人全血。因此，这不是患者样本，而是健康个体的样本，我们在准备将血液注入微流控装置之前使用该样本。接下来，我们将注射器连接到注射泵上。现在启动设备，您可以看到注射器的流速，我们已将其设定为每分钟5微升。现在，我们基本上要准备向血液中注射。我们将注射器泵垂直放置，因为众所周知，血细胞会沉降，我们需要让细胞流入通道内。因此，最好让细胞沉降到靠近管路的底部。现在所有设置均已准备就绪。我的装置体积为每10微升10微升。我们希望流入通道壁的体积也是10微升。因此，我可以通过观察通道的颜色来判断是否已注入足够的血液：如果通道完全充满红色，则说明已注入10 µL，此时应停止推动注射器推杆。现在我将按下启动按钮，设备有时会立即开始运行，但有时需要一段时间血液才会真正进入通道，这在很大程度上与压力有关。例如，当我们把注射器安装到位后，有时需要相应地回抽或注入液体，以调节管路中的血液。因此可能需要一些时间，但一旦血液开始泵入通道，流速就会稳定在每分钟设定的数值，这正是我们期望的。所以我们需要稍有耐心，等待一段时间，有时可能需要等待两到三分钟，血液才会开始进入通道。实际上，你现在可以看到血液正开始进入通道。因此你可以判断，目前该装置几乎已完全充满。好的，现在我们将管路切换回 PBS，以冲洗通道中的血液。为此，我们将重复之前移除管路的操作步骤。由于仍需控制 PBS 的流速，因此仍需使用注射泵。然而，由于不再灌注血液，PBS 中不含细胞，因此无需将注射泵保持在垂直位置。现在我们已准备就绪，接下来将冲洗掉装置中的血液，我将再次按下此处的锐器按钮。正如您所见，装置正逐渐开始变得清晰，边缘还残留少量血液，但正在缓慢消失。因此，当所有血液流尽后，我们将流速从每分钟5 µL提高到每分钟20 µL。这一调整的原因在于，血液中实际上存在两种带有C四阳性抗原的细胞类型，其中一种就是我们所要寻找的辅助性T淋巴细胞。另一种是我们称之为单核细胞的细胞。我们需要确保我们的装置能够特异性地捕获辅助性T淋巴细胞，而不是同时捕获辅助性T淋巴细胞和单核细胞。为此，我们采用的方法是提高流速，因为单核细胞的体积大于辅助性T细胞。因此，通过提高流速，较大的单核细胞所受到的脱离表面的压力将大于CD4阳性辅助T细胞。现在大约已过去20分钟。我手中目前拿着的是一种溶液。它被称为传真裂解液解决方案。其在此处的作用是裂解红细胞。因此，通道中残留的任何红细胞都将被该溶液裂解。将原液稀释10倍，共稀释10次。接下来，我们将停止注射泵，取下管路，并用此注射器中的溶液替换原有溶液。现在我将关闭仪器，取下管路，拆下原有注射器，将其与该注射器连接，并更换为新的注射器。好的，现在所有设备已准备就绪，我们将流速调回每分钟5微升。因此，我们将流速从20调至5，然后以该流速注入fax license溶液，持续20分钟。现在我们开始运行。目前我们面前是一张以 10 倍放大倍数拍摄的器件光学图像。可以看到这里所有的白色斑点。那么，我们如何确认这些细胞就是我们所要寻找的细胞呢？因此，我们使用几种不同的染料，其中第一种染料是我们称为DPI的染料，它会对细胞核进行染色。基本上，任何含有细胞核的细胞，例如白细胞，都会被染上颜色；而像红细胞这样没有细胞核的细胞则不会被染色。从图像上可以明显看出，整个视野中分布着大量蓝色的点，每一个蓝色的点都代表一个被染色的细胞核。是一个细胞。接下来的步骤是检测这些细胞是否具有我们所说的C四阳性抗原。这一步骤极为重要，因为我们的设备的全部目的就是捕获C四阳性细胞。因此，接下来我们使用的荧光抗体当然是针对 C4 特异性的。请看下一张幻灯片。在这张图片中，细胞的荧光信号明显更弱，是因为我们使用的荧光抗体通常用于 FACS 分析。因此稀释倍数要高得多。但如果仔细观察，仍然可以看出在这个视野中散布着一些微弱的点状物，它们相当暗淡。但经过更仔细的观察，我们可以发现这些细胞是DC阳性的，这是理想的，因为这正是我们所期望的结果。接下来的检测是，正如我之前提到的，存在两种不同类型的C4阳性细胞：一种是我们所需要的辅助性T细胞，另一种则是我们称之为单核细胞的细胞。因此，我们需要另一种荧光抗体来区分这两种细胞。我们知道，在辅助性T淋巴细胞上存在所谓的CD3阳性抗原，而单核细胞则没有。因此，我们接下来使用的抗体是特异性针对CD3的，这一点可以从本图中看出。同样，您可以看到这些点状信号零星分布在芯片上，这些点看起来更大，是因为有时某些细胞的荧光信号较强，而另一些则较弱。我的意思是，在这种情况下，很多因素都具有随机性，但大多数情况下，这些亮红色的点代表的都是细胞。因此，我们再次确认，我们的目标是确保细胞为 CD4 阳性和 CD3 阳性。在这种情况下，可以看出，我们的大部分细胞为 CD3 阳性，这是理想的，因为它提高了我们捕获的特异性。较大的信号可能为杂质，但很多时候实际情况是，某些细胞恰好聚集了更多的CD3抗体，即CD3。因此，在本图中，这是我们为此微流控装置收集的数据之一，其基本原理为细胞捕获检测。而在之前的幻灯片或其他资料中，您可以看到大量含有细胞的图像。但它们实际上会累积成什么？它们会累积成一个细胞捕获分布图，其中横轴表示距离入口的距离，纵轴表示捕获的细胞圆盘。可以看出，在整个装置中，细胞密度最初非常高，随后逐渐降低，这正是我们所预期的结果，因为我们正在从血液中捕获C4阳性及C3阳性细胞，而血液样本中这些细胞的浓度会随之逐渐减少。这基本上就是我们的数据通常呈现的方式。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

CD4 + T淋巴细胞艾滋病毒的捕获使用一次性微流体芯片

使用微流控装置捕获细胞

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1...

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从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

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单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。...

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基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

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