CD4 + T淋巴细胞艾滋病毒的捕获使用一次性微流体芯片

您好，我叫 Richard Lin，是哈佛大学与麻省理工学院健康科学与技术部 TI Mercy 教授课题组的一名研究人员。我正在开展的项目是定量并捕获患者血液中的 CD4 阳性和 CD3 阳性 T 淋巴细胞，该技术将用于资源有限的医疗环境。

就在我面前的是一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微填充装置。该装置的通道本身高为50微米，装置内的总体积为10微升。这是一个极为精密的装置，我们将用它来捕获辅助性T淋巴细胞。

基本上，这是针对 HIV 患者的诊断基准。微流控装置的表面已预先固定了蛋白质和 CD4 阳性抗体，并装入注射器中。目前我们使用的是 pH 为 7.4 的 PBS 生物缓冲液，接下来将该缓冲液注入通道，以冲洗掉多余的 CD4 阳性抗体。

在此阶段，流速无需控制，因为我们只是要冲洗掉多余的物质，流速的具体数值并不重要。此处将是装置的入口，而此处将是出口，即在我左侧、你们右侧的位置。现在我将冲洗掉多余的抗体溶液，如果观察出口处，可以看到液体流出，虽然量非常少，但仔细观察可以发现，空气和液体正通过管道从通道中流出。

现在我们已经冲洗掉多余的抗体溶液，接下来可以准备注入血液。现在我将拔下入口处的管路，打开一支新的注射器以装入血液，即人全血。

因此，这不是患者样本，而是健康个体的样本，我们在准备将血液注入微流控装置。接下来，我们将注射器连接到注射泵上。现在启动设备，您可以看到注射器的流速，我们已将其设定为每分钟5微升。

现在，我们将为向血液中注射做好基本准备。我们会将注射泵垂直放置，因为众所周知，血细胞会发生沉降，而我们希望细胞能够流入通道内。因此，应让细胞沉降到靠近导管的底部。

现在所有准备工作均已就绪。我的装置体积为每10微升10微升。我们需要流入通道壁的体积也是10微升。

因此，我可以通过观察通道的颜色来判断是否已注入足够的血液：如果通道完全充满红色，则说明已注入10 µL，此时应停止推动注射器活塞。现在我将按下启动按钮，系统有时会立即开始运行，但有时需要一段时间血液才会真正进入通道，这在很大程度上与压力有关。

例如，当我们把注射器安装上去后，有时需要相应地回抽或注入液体，以调节导管中的血液。因此，这个过程可能需要一些时间，但一旦血液开始进入通道，流速就会稳定在每分钟设定的毫升数，这正是我们期望的流速。因此，我们需要稍有耐心，等待一段时间，有时需要等待两到三分钟，血液才会开始流入通道。

实际上，你现在可以看到血液正开始进入通道。因此你可以判断，目前该装置几乎已完全充满。好的，现在我们将管路切换回PBS，以冲洗通道中的血液。

为此，我们将重复之前移除管路的操作步骤。由于仍需控制 PBS 的流动速率，因此仍需使用注射泵。然而，由于不再灌注血液，PBS 中不含细胞，故无需再将注射泵保持在垂直位置。

现在我们已准备就绪，接下来将冲洗掉装置中的血液，我将再次按下此处的锐器按钮。正如您所见，装置正逐渐开始变得清晰，边缘还残留少量血液，但正在缓慢消失。

因此，一旦血液完全流尽，我们将流速从每分钟5 µL提高到每分钟20 µL。这种调整的原因在于，血液中实际上存在两种带有C四阳性抗原的细胞类型，其中一种就是我们所寻找的辅助性T淋巴细胞。

另一种是我们称之为单核细胞的细胞。我们需要确保我们的装置能够特异性地仅捕获辅助性T淋巴细胞，而不是同时捕获辅助性T淋巴细胞和单核细胞。为此所采用的方法是提高流速，因为我们知道单核细胞的体积大于辅助性T细胞。

因此，通过提高流速，较大的单核细胞所受到的脱离表面的压力将大于CD4阳性辅助T细胞。现在大约已过去20分钟。我手中目前拿着的是一种溶液。

它被称为传真裂解液解决方案。该溶液的作用是裂解红细胞。因此，通道中残留的任何红细胞都将被该溶液裂解。

将原液稀释10倍，共稀释10次。接下来，我们将停止注射泵，取下管路，并用此注射器中的溶液替换原有溶液。现在我将停止仪器运行，取下管路，拆下原有注射器，将其与该注射器连接，并更换为新的注射器。

好的，现在所有设备都已设置完毕，我们将流速调回每分钟5微升。因此，我们将流速从20调低至5，然后以该流速注入fax license溶液，持续20分钟。现在我们开始运行。

目前我们面前是一张以 10 倍放大倍数拍摄的器件光学图像。可以看到这里所有的白色斑点。那么，我们如何确认这些细胞就是我们所要寻找的细胞呢？

因此，我们使用几种不同的染料，其中第一种染料是我们所谓的DPI染料，它可对细胞核进行染色。基本上，任何含有细胞核的细胞，例如白细胞，都会被染色；而像红细胞这样无细胞核的细胞则不会被染色。从图像上可以明显看出，整个视野中分布着大量蓝色的点，每一个蓝色的点都代表一个被染色的细胞核。

是一个细胞。接下来的步骤是检测这些细胞是否具有我们所说的C四阳性抗原。这一点极为重要，因为我们的设备的全部目的就是捕获C四阳性细胞。

因此，接下来我们使用的荧光抗体当然是针对 C4 特异性的。请看下一张幻灯片。在这张图片中，细胞的荧光信号明显更弱，是因为我们使用的荧光抗体通常用于 FACS 分析。

因此稀释倍数要高得多。但如果仔细观察，仍然可以看出视野中散布着一些微弱的点状物，它们相当暗淡。

但经过更仔细的观察，我们可以发现这些细胞是DC阳性的，这是理想的，因为这正是我们所期望的结果。接下来的检测是，正如我之前提到的，存在两种不同类型的C四阳性细胞：一种是我们所需要的辅助性T细胞，另一种则是我们称之为单核细胞的细胞。

因此，我们需要另一种荧光抗体来区分这两种细胞。我们知道，在辅助性T淋巴细胞上存在所谓的CD3阳性抗原，而单核细胞则没有。

因此，我们接下来使用的抗体是特异性针对CD3的，这一点可以从本图中看到。同样，您可以看到这些点状信号零星分布在芯片上，这些点的大小看起来有所不同，因为有时某些细胞的荧光信号较强，而另一些则较弱。我的意思是，在这种情况下，很多因素都具有随机性，但大多数情况下，这些亮红色的点代表的都是细胞。

因此，我们再次确认，我们的目标是确保细胞为 CD4 阳性和 CD3 阳性。在这种情况下，可以看出，我们的大部分细胞为 CD3 阳性，这是理想的，因为它提高了我们捕获的特异性。

较大的信号可能是杂质，但很多时候，实际情况是某些细胞恰好聚集了更多的CD3抗体，即CD3结合到了细胞自身。因此，在这张图中，这是我们为此微流控装置收集的数据之一，基本上是一个细胞捕获过程。而在之前的图中，例如载玻片等，可以看出有很多包含细胞的图像。

但它们实际上会累积成什么？它们会累积成一种细胞捕获分布图，其中我们可以将横轴（X 轴）设为距入口的距离，纵轴（Y 轴）设为捕获的细胞圆盘。可以看出，在整个装置中，细胞密度最初非常高，随后逐渐降低，这正是我们所预期的结果，因为我们正在从血液中捕获 C4 阳性及 C3 阳性细胞，而这些细胞在血液样本中的浓度会随之逐渐减少。

这基本上就是我们的数据通常呈现的方式。