0 次观看 • 4:47 分钟 • April 28th, 2025
从一个用胶带固定在玻璃载片上的已解剖的Drosophila胚胎开始。
果蝇的运动神经元被荧光标记以进行可视化。
使用显微镜观察胚胎，并将一支充满绿色荧光脂溶性染料的微细移液管置于胚胎附近。
然后，切换至荧光模式，定位运动神经元在神经肌肉接头处的轴突末端，即运动神经元与肌肉连接的位置。
切换至明场模式，用移液管接触目标轴突的末端，释放一滴染料，然后进行孵育。
由于其亲脂性以及靠近轴突的位置，染料可选择性地进入目标轴突富含脂质的膜结构中。
随着时间推移，染料发生逆行运输，沿轴突的脂质双层向神经元胞体方向逆向移动，从而标记神经元的投射纤维。
从载玻片上移除胶带，并放置盖玻片。
在共聚焦显微镜下观察切片。
逆行标记的目标神经元呈现绿色荧光，显示出详细的神经元形态及其投射结构。
在解剖显微镜下使用玻璃针将胚胎从胶带上的卵黄膜中轻轻拖出至载玻片表面，注意不要损伤胚胎内部组织。随后，沿单个胚胎表面的中线从后端至前端进行切割。将表皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附在载玻片表面。
使用连接针头的移液管，针头开口直径约为300微米，吸取或吹入空气以去除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。用4%多聚甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下于旋转摇床上固定胚胎5分钟，随后用PBS洗涤三次。
将1微升与Cy3染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体和200微升PBS加入胚胎中，在摇床上孵育一小时。随后用PBS重复洗涤。为填充注射用微量移液管，将其放入毛细管架中。接着将染色载玻片置于载物台上，并使用显微操作器将其定位到载玻片上方。
然后调节载物台，将微移液管置于染料上。通过将注射压力设为200至500百帕，注射时间设为0.1至0.5秒，补偿压力设为0并持续5分钟，来吸取染料。染料吸取完成后，移除染料载玻片，并将样品放置到显微镜载物台上。
然后将补偿压力增加至30至60百帕的范围，并将微移液管插入样品中。使用10倍物镜定位胚胎，并将微移液管与胚胎对齐。更换物镜为40倍水浸镜头，并将镜头浸入PBS中。
使用荧光显微镜观察由抗-HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。当胚胎处于焦平面时，调整微移液管的位置，使其尖端轻柔接触目标轴突的末端。注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。将DiD或DiO染料滴加至腹部右侧半体节中ACC或RP3的神经肌肉接头处。
使用手动控制器释放染料并移出微量移液器，然后转移到下一个注射位点。在成像前，将样品置于旋转摇床上，室温孵育1小时。用精细镊子从载玻片上移除胶带。
安装样品时，准备一张盖玻片，并在四个角上涂抹少量真空脂。小心地将其放置在样品上，注意避免产生气泡。轻压盖玻片，以调节样品与盖玻片之间的间距，从而为物镜与载玻片之间留出足够的工作距离。
用纸巾吸去多余的PBS。用指甲油完全密封盖玻片的边缘。使用共聚焦显微镜在10倍和100倍放大倍数下进行成像，并用ImageJ软件处理图像。