器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

从共聚焦显微镜浴槽装置开始，该装置配备循环成像溶液和温度控制。

取一块亲水性聚合物膜，其上含有一个脑切片类器官，该小鼠脑切片中的少突胶质细胞已通过转导表达一种线粒体特异性的红色荧光蛋白和一种细胞质特异性的绿色荧光蛋白。

双荧光可清晰显示少突胶质细胞胞质内线粒体的动态变化。

将切片浸入浴槽中央，并用网格状固定器固定。

降低物镜，选择一个健康的少突胶质细胞用于扫描。

调整激光功率以最小化细胞毒性和光漂白。

设定显微镜参数，然后记录荧光标记的线粒体的时间序列图像。

在不同深度采集z轴层扫图像，以获得整个细胞的高分辨率三维视图。

处理图像以可视化少突胶质细胞内的线粒体运动。

使用镊子将带有切片的彩屑从培养皿转移到浴槽顶部。然后将镊子的两个尖端分别放在彩屑两侧，使其接触彩屑但不接触切片，将彩屑推过溶液至浴槽底部。将彩屑置于浴槽中央。

使用镊子将固定锚或琴弦（harp）放置在confetti上方，注意不要触碰到脑片。然后重新启动蠕动泵。将物镜下降至样品位置，接着通过目镜和荧光灯快速寻找一个形态良好且表达荧光蛋白的少突胶质细胞。

使用软件中的实时功能在屏幕上识别细胞，并选择感兴趣的区域。此处将对包含多个初级突起和一段髓鞘的区域进行成像。放大至目标区域，通常可获得像素大小为 0.14 至 0.30 微米的图像。

选择“区域”工具，在目标区域周围绘制一个矩形。选择仅扫描选定区域的选项。通过仅扫描选定区域，可缩短扫描时间，从而减少激光暴露。

调整激光功率和增益以清晰观察线粒体。进行活细胞成像时，应使用低激光功率和高增益，以避免光漂白。如有必要，调整数字偏移。

通过选择快速扫描速度来缩短扫描时间。设定线粒体成像和少突胶质细胞延时记录的频率与持续时间。每2秒采集一次图像，共持续20分钟。开始延时记录。

溶液的持续流动可能导致切片移动。可通过调节灌流室的进液口和出液口，尽量减少这种移动，这值得花费一些时间。您也可以降低泵的转速。

在延时成像过程中需持续监测屏幕，因为通常仍会发生微小的焦距变化。根据需要调整焦距。延时成像结束后，对整个细胞采集一个Z-stack图像，以便后续识别该细胞及所成像的过程。