小鼠脑切片中海马神经元激活的成像

从暴露出背侧海马体的小鼠脑切片开始，该区域富含神经元。

加入过氧化氢以淬灭神经元过氧化物酶活性，随后进行洗涤。

用透化缓冲液处理，然后加入封闭缓冲液以阻断非特异性结合。

加入一抗并轻轻振荡孵育。这些抗体可结合神经元活化标志蛋白。

洗涤并加入生物素标记的二抗以结合一抗。

冲洗并加入亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，使其与结合物上的生物素结合。

再次洗涤，然后加入显色底物，该底物被过氧化物酶氧化生成棕色沉淀。用PBS终止反应。

将切片转移至明胶包被的载玻片上，并使用浓度递增的乙醇进行脱水。随后用二甲苯透明切片，然后封片。

将玻片置于明场显微镜下。

在光照下，未染色区域透光而呈现明亮，而染色的神经元吸收并反射光线，显得较暗。

较深的特定区域表明海马体内的神经元被激活。

将每只小鼠的三至五片背侧海马组织切片转移至24孔板的各孔中，每孔加入500 µL 0.1 mol/L PBS。用500 µL 0.1 mol/L PBS对每孔中的切片进行洗涤。除非另有说明，所有洗涤和孵育步骤均在室温下轻柔振荡进行。在通风橱内，将切片置于含40%甲醇和1%过氧化氢的0.1 mol/L PBS溶液中孵育20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

在0.1摩尔PBS中再清洗三次后，将切片在500微升0.2% Triton X-100中孵育5分钟以进行通透处理。在切片孵育期间，准备足量的封闭缓冲液用于整个实验。随后，移除通透溶液，并向每个孔中加入100微升封闭缓冲液。将切片孵育1小时。

接下来，移除封闭缓冲液，并用磷酸化细胞外调节激酶一抗覆盖切片，该一抗用封闭缓冲液按1:500比例稀释。将切片在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日，用0.1摩尔PBS缓冲液洗涤切片三次，每次5分钟，随后在室温下用生物素标记的二抗按1:250比例稀释于封闭缓冲液中孵育切片一小时。

孵育期间，需在使用前至少30分钟配制ABC试剂，以确保有足够的时间形成亲和素与生物素的复合物。用0.1摩尔PBS将切片再洗涤三次后，加入ABC试剂，并使其与样本孵育45分钟。在接下来的三轮PBS洗涤过程中，根据生产商的说明，在通风橱中配制DAB工作液。将DAB工作液分装至培养板中。

然后将切片转移至含有DAB工作液的孔中，轻轻摇动培养板，使切片充分接触溶液。在显微镜下监测DAB反应，约两到五分钟内待信号显色达到理想程度。当颜色强度达到预期时，用0.1摩尔PBS洗涤组织以终止反应。再用PBS洗涤三次后，将切片贴附于明胶包被的载玻片上，并在室温下干燥至少三到四小时。

待空气干燥后，将载玻片转移至通风橱中，依次放入梯度乙醇溶液中，每级脱水两分钟。随后在100%二甲苯中透明处理五分钟。用封片介质封片，并将载玻片置于通风橱中过夜干燥。

将切片转移至配备相机的明场显微镜下，使用20倍物镜。在200倍放大倍数下，对每个切片的背侧海马区域采集多张明场图像。每只动物采集三到五张切片图像。