小鼠视网膜的双光子体内成像

取一只麻醉的转基因小鼠，其头部以一定角度固定在支架上，用于小鼠视网膜的体内成像。

视网膜含有表达荧光团标记蛋白的视网膜神经节细胞或RGC。

涂抹眼部润滑剂并在眼睛上安装盖玻片。

在显微镜下，均匀照射视网膜以激发 RGC 中的荧光蛋白。

使用发射的荧光，获得焦平面 RGC 和失焦 RGC 的宽视场视图。

切换到双光子成像模式，将低能近红外光聚焦到RGC层。

在焦点处，来自两个光子的组合能量激发荧光团，然后荧光团释放能量作为荧光。

由于激发仅限于单个点，因此来自其他焦平面的荧光被最小化。

沿z轴的多个焦平面捕获图像，以对整个RGC图层进行成像。

润滑剂滴眼液涂抹在小鼠的双眼上。旋转头部支架的主臂，直到一只眼睛的瞳孔与光路对齐，然后将 1.5 号盖玻片放入紧凑的滤光片支架中。将支架固定到显微镜载物台后，降低盖玻片，直到它接触润滑剂 i-gel 而不接触角膜。并在xy维度和物镜z位置调整载物台，直到宽场激发光完全覆盖角膜。

使用目镜继续调整 z 位置，直到视网膜中的荧光细胞或结构聚焦，根据需要增加落射荧光照明器以解析感兴趣的单个细胞或结构。微调视网膜与成像光路的对齐。调整头部角度，直到改变焦平面时仅发生失焦光的膨胀或收缩，从而最大限度地减少 xy 失真。

然后关闭落射荧光照明器并关闭照明器快门。对于双光子成像，请遵循所有机构激光安全协议。关闭并覆盖所有环境光，并将激发光路切换到激光，将发射光路切换到PMT。

在图像采集软件中，将帧大小设置为 512 x 512，帧平均值设置为 3。将 z 步进设置为从堆栈顶部开始并向下进行，从而最大限度地减少光感受器的双光子激光激活。打开并启用 PMT，并将电压调整为 680 伏。

启用成像和发射快门。从 1% 激光功率开始对目标组织进行实时图像预览，并自动调整显示亮度以可视化感兴趣的细胞或结构。如果目标组织昏暗或不清晰，请增加激光功率百分比，直到结构变得可见而不超过 45 毫瓦。

沿 xy 方向纵显微镜载物台以所需的成像区域为中心，并导航到 z 平面，焦点是感兴趣的结构。对于慢性延时实验，打开先前获得的图像以用作感兴趣细胞的参考，注意当前图像中的成像角度与先前图像的成像角度相似。然后导航到感兴趣的最上方和最下方的 z 平面，以设置成像堆栈的 z 限制并获取图像。