活体小鼠视网膜的双光子成像

取一只已麻醉的转基因小鼠，将其头部以一定角度固定在固定器上，用于活体成像小鼠视网膜。

视网膜包含表达荧光蛋白标记蛋白的视网膜神经节细胞（RGCs）。

涂抹眼润滑剂，并在眼睛上覆盖盖玻片。

在显微镜下，均匀照射视网膜以激发视网膜神经节细胞（RGCs）中的荧光蛋白。

利用发射的荧光，获取焦平面视网膜神经节细胞（RGCs）和离焦视网膜神经节细胞（RGCs）的宽场图像。

切换至双光子成像模式，将低能量的近红外光聚焦到视网膜神经节细胞层。

在焦点处，两个光子的联合能量激发荧光分子，随后其以荧光形式释放能量。

由于激发光局限于单个点，来自其他焦平面的荧光被降至最低。

沿 z 轴方向在多个焦平面上采集图像，以成像整个视网膜神经节细胞层。

在小鼠的两只眼睛中滴加润滑性眼药水。旋转头部固定装置的主臂，使其中一只眼睛的瞳孔与光路对齐，并将一个1.5号盖玻片放入紧凑型滤光片支架中。将支架固定到显微镜载物台上后，缓慢降低盖玻片，使其接触润滑性i-gel，但不接触角膜。调节载物台的xy方向位置以及物镜的z轴位置，直至宽场激发光完全覆盖角膜。

使用目镜继续调整 z 轴位置，直至视网膜中的荧光细胞或结构清晰对焦，必要时增加落射荧光照明强度，以分辨出感兴趣的单个细胞或结构。精细调节视网膜与成像光路的对准。调整头部角度，使得在改变焦平面时仅出现离焦光的扩展或收缩，从而将 xy 方向的畸变降至最低。

然后关闭落射荧光照明器并关闭照明器快门。进行双光子成像时，须遵守所有机构规定的激光安全规程。关闭并遮蔽所有环境光，将激发光路切换至激光器，发射光路切换至光电倍增管（PMT）。

在图像采集软件中，将帧大小设置为 512 × 512，帧平均值设置为 3。设置 z 轴步进从堆栈顶部开始并向下推进，以最小化双光子激光对光感受器的激活。打开并启用 PMT，将电压调节至 680 伏特。

打开成像快门和发射快门。以1%的激光功率开始对目标组织进行实时图像预览，并自动调节显示亮度以观察目标细胞或结构。如果目标组织信号微弱或不清晰，可逐步提高激光功率百分比，直至结构可见，但不得超过45毫瓦。

在 xy 方向上移动显微镜载物台，使目标成像区域居中，并调节至 z 平面，使感兴趣的结构处于焦点位置。对于长期时间序列实验，打开先前获取的图像作为感兴趣细胞的参考，注意当前图像的成像角度应与之前图像的角度相似。然后移动至感兴趣区域的最上方和最下方 z 平面，以设定成像堆栈的 z 范围，并采集图像。