利用颅骨植入物进行神经-免疫动态的荧光成像

从一只已麻醉的转基因小鼠开始，该小鼠颅骨上植入了圆形玻璃成像窗和头固定板。

小胶质细胞或免疫细胞以及神经元均用荧光蛋白进行标记。

接下来，将小鼠固定在双光子显微镜的载物台上。

然后，通过腹腔注射荧光染料，将血管染成红色。

清洁玻璃成像窗口，滴加一滴生理盐水，然后降低显微镜物镜。

接下来，调节激光光源以获取血管图像。记录分支模式和坐标，以便后续定位并再次成像同一区域。

现在，设置激光以激发荧光蛋白，使小胶质细胞和神经元发出荧光。

根据记录的分支模式，定位相同区域并定期采集细胞图像。

血管网络和神经元保持稳定，而小胶质细胞位置随时间发生的变化则反映了对神经元活动的免疫动态响应。

使用牙科钻头在颅骨上钻一个直径约4毫米的圆形开口。钻孔过程中，应定期用无菌生理盐水和棉签湿润颅骨，以冷却脑组织。清除骨屑并软化颅骨。

操作完成后，用尖头镊子小心地移除这部分颅骨。颅骨去除后，将一小块用生理盐水润湿的盖玻片小心地放置在颅窗上。用无菌擦拭纸吸去多余的生理盐水。使用尖头涂抹器，在窗周涂抹氰基丙烯酸酯胶水，使其与脑组织和颅骨粘附。

将底漆胶涂抹至颅骨其余区域，并用固化灯照射20至40秒进行固化。用终末胶在窗口周围构建一个凹槽结构，并用固化灯照射20至40秒使其固化。使用底漆胶将一小块头固定板粘附于颅窗对侧半球的颅骨上，随后使用终末胶进行固定，两种胶均需用固化灯照射20至40秒完成固化。

小鼠苏醒后，皮下注射一剂缓释布托啡诺作为术后镇痛，该剂量可持续镇痛72小时。为小鼠提供额外的软质食物以促进健康恢复。植入手术后最早可在两周时进行成像。使用螺丝将头固定板安装在双光子显微镜载物台上，载物台应通过加热板维持在35摄氏度。

向小鼠皮下注射100微升血管染料（如罗丹明B）。用蘸有70%乙醇的棉签轻轻清洁颅窗表面。在颅窗上滴加几滴水或生理盐水，并将物镜浸入溶液中。在降低物镜时，确保激光器处于关闭状态。

通过目镜观察时，手绘脑区血管图以标记主要的血管解剖标志。利用此图在双光子成像过程中识别特定区域。使用双光子成像采集荧光标记的细胞和血管图像。成像参数详见正文。仔细记录相应的坐标信息，以确保后续成像时能够准确定位并重复观察相同区域。

在此初始成像过程中采集多个视野。