转基因小鼠膈肌神经肌肉接头处钙动力学的荧光成像

从一个固定了膈肌及膈神经的转基因小鼠开始，将其置于荧光显微镜系统中。

膈肌的神经肌肉接头由运动神经元、肌纤维以及含有乙酰胆碱受体和钙通道的施万细胞组成。

这些细胞具有荧光标记的乙酰胆碱受体，并表达细胞内钙指示剂。

安装在装置上的图像分光器可实现两种荧光信号的同步可视化。

将膈神经置于吸电极中以施加电刺激。

在荧光显微镜下观察乙酰胆碱受体，以鉴定神经肌肉接头。

为了设定最大基础荧光强度，加入氯化钾溶液以暂时去极化细胞膜。这会触发细胞内钙离子内流，导致指示剂的荧光增强。

调整亮度设置，以防止荧光信号过饱和。

复极化后，施加电刺激以触发钙离子进入细胞，并以高帧率记录细胞内荧光的变化。

在20倍放大倍数下，通过在绿黄光激发下观察荧光标记的α-银环蛇毒素神经肌肉接头，定位肌肉中心的终板带。切换至蓝光激发以成像肌肉、运动神经元或施万细胞中的钙反应。在此示例中，GCaMP3在肌细胞中表达。

如有需要，可使用带通滤光片和二向色单边滤光片搭建图像分光器，以实现双波长成像。实验时，将查找表条上的亮度条设置为氯化钾刺激下，转基因编码钙指示剂表达组织在20倍放大、无像素合并条件下达到饱和时荧光强度的110%。

以每秒 20 帧的速度进行记录，以避免遗漏任何快速事件。使用吸吮电极传递一连串刺激脉冲，对神经施加 1 至 45 秒、20 至 40 赫兹的刺激。同时采集一种细胞亚型中的动态荧光钙反应，以及静态荧光标记的 α-银环蛇毒素神经肌肉接头信号。