双色受激拉曼散射成像小鼠脑组织

将小鼠脑切片置于载玻片上的孵育 chamber 中，并将其放置在配备受激拉曼散射（SRS）成像系统的显微镜下。

将两束同步的激光束（称为泵浦光束和斯托克斯光束）聚焦到组织上。

这两束光之间的能量差与特定分子的振动频率相匹配，从而诱导分子振动。

利用同步激光束的不同频率组合，激发具有独特分子振动特性的组织脂质和蛋白质。

激发过程促进两束光之间的能量转移，导致泵浦光束强度降低，同时斯托克斯光束强度增加。

这种相对强度的变化被检测为SRS信号，可用于识别相应分子。

光电探测器收集来自样品的综合SRS信号。

为脂质和蛋白质信号分别赋予不同颜色，生成双色图像，以识别脑组织中的蛋白质和脂质。

在斯托克斯光束光路中放置一个分束器，以拾取10%的光束，并将其导入快速光电二极管，用于检测8 MHz的脉冲序列。取扇出缓冲器的一个输出信号，通过带通滤波器滤波，获得20 MHz的正弦波。然后，使用射频衰减器将输入/输出峰峰值电压调节至约500毫伏。将处理后的输出信号送入相位调节器，通过电压源实现对射频相位的精细调节。

将此输出发送至射频功率放大器，并将放大器的输出连接至电光调制器（EOM）。解除斯托克斯光束的遮挡后，通过在光路中放置光电二极管来优化第一个EOM的调制深度。调节EOM电压和四分之一波片，直至调制深度达到满意水平。在二向色镜后放置一个光电二极管以检测激光束。首先遮挡斯托克斯光束，然后在示波器上放大其中一个泵浦脉冲峰。使用示波器放置垂直光标，标记该峰的时间位置。

现在，遮挡泵浦光束，并打开斯托克斯光束。移动延迟线平台，通过计算使两束光峰值位置重合所需的延迟距离，将示波器上的峰值位置暂时调整至前一步骤中标记的位置，随后延长较快光束的光路，或缩短较慢光束的光路。

接下来，使用DMSO和双面胶带作为间隔物，制备显微镜载玻片样品，将样品夹在载玻片与盖玻片之间。将样品放置在显微镜上，使盖玻片一侧朝向显微镜物镜，并在明场照明下通过目镜观察样品。在玻璃与胶带界面处的气泡顶层和底层分别找到样品的焦平面。然后，将焦点移至两层胶带之间的中间位置。

接下来，将可调谐光束的输入/输出波长设置为798纳米。根据聚光镜的光学透过率，调节光学功率，使泵浦光束和斯托克斯光束在物镜焦点处的功率均约为40毫瓦。然后在Matlab中打开扫描图像，并点击标有“Focus”的按钮以开始扫描。调节振镜扫描器前的转向镜，使直流信号在通道1的显示中居中。

移动电动延迟台，并密切观察通道二显示的锁相放大器输出。最后，调节时间延迟以最大化交流信号强度。调节二向色镜，使SRS信号在交流通道上居中。然后，调节锁相放大器的相位以最大化信号。

安装样品后，将样品载入显微镜，并如前所述将两束光的功率均调节至样品焦点处约40毫瓦，随后从Matlab中打开扫描图像。然后，通过扫描对应于DMSO的2913 cm⁻¹拉曼峰的延迟阶段，找到最大的SRS信号。

获取对应于