清醒小鼠小胶质细胞动力学和神经元活动的同时成像

首先将转基因小鼠固定在立体定向框架中，在其视觉皮层上植入颅窗。

小鼠在小胶质细胞中表达EGFP，在视觉皮层的神经元中表达R-CaMP，一种红色荧光钙指示剂。

鼠标置于双光子显微镜下，调整物镜以聚焦在脑表面。

带有立体定向框架的鼠标从物镜上移开，并安装遮光装置。

将遮光装置装满水，然后将鼠标重新定位在显微镜下。

用黑箔覆盖镜头。

遮光装置和箔片可阻挡外部光线干扰，确保成像准确。

将液晶显示器放在鼠标眼睛前以提供视觉刺激。

设置成像参数并开始成像。

视觉刺激触发神经元兴奋，导致钙流入和 R-CaMP 荧光增加。

同时，正如通过实时成像观察到的那样，小胶质细胞在与激活的神经元相互作用时会缩回它们的过程。

要安装定制的遮光装置和用于视觉刺激的液晶显示器，首先，将镜头定位在大脑表面。然后将此镜头位置设置为原始 z 位置。保持 x、y 坐标恒定并抬高物镜。从物镜上取下鼠标和立体定位仪器。使用硅胶在头板顶部安装遮阳装置，确保头板与遮阳装置之间的空间密封良好。

蒸馏水填充遮阳装置。然后，将鼠标与立体定位框架固定在物镜下方。小心地重置脑表面的焦平面，检查物镜的深度。用黑色铝箔覆盖物镜，以避免液晶显示器的光污染。将 10 英寸液晶显示器设置在鼠标眼前 12.5 厘米处，以呈现视觉刺激。

配置 EGFP 和 RCaMP 的荧光发射收集滤光片，激发波长为 1,000 纳米。获取空间分辨率为每像素 0.25 微米的图像。找到 RCaMP 阳性神经元和 EGFP 阳性小胶质细胞可以同时在第 2/3 层成像的成像区域。

以 30 赫兹的帧速率采集图像。同时，随着图像采集，以 30 度步长向小鼠呈现 12 个方向，从 0 到 150 度的 6 个方向漂移光栅视觉刺激。