使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

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取注射了

溴脱氧尿苷或BrdU(胸苷的核苷类似物)的大鼠的海马脑切片。

BrdU 在细胞分裂过程中整合到 DNA 中,标记齿状回内新生成的神经元,齿状回是神经发生区域。

与氧化剂一起孵育以灭活内源性过氧化物酶。

用酸处理使DNA变性并暴露BrdU,然后中和酸。

与浸清剂孵育以透化细胞膜和封闭溶液以掩盖非特异性结合位点。

与靶向 BrdU 的一抗一起孵育,然后与一抗特异性的过氧化物酶标记二抗一起孵育。

引入显色底物和氧化剂,使过氧化物酶将底物转化为有色残基。

安装组织并用核酸结合染料复染。

使

组织脱水,然后对其进行处理以增加透明度。

在显微镜下,识别齿状回。

使用光学分馏器技术,分析组织厚度上的多个平面,以量化 BrdU 标记的神经元。

准备好开始免疫染色后,让切片达到室温。然后用画笔将每五个切片从一系列海马切片转移到放置在装有PBS的培养皿中的25孔染色网上。每个海马体应有 8 到 12 个切片进行染色。将含有切片的染色网转移到含有PBS的匹配玻璃培养皿中,并在PBS中洗涤切片两次,持续10分钟。

然后,在 3% 过氧化氢中孵育 20 分钟。洗涤后,将切片通过三种盐酸溶液移动。然后,在室温下用0.1摩尔四硼酸钠中和20分钟。

在更换洗涤缓冲液中孵育 3 次 10 分钟后,将切片转移到室温下封闭溶液中一小时。然后,将切片在小鼠抗BrdU中孵育,在封闭溶液中稀释1至100,在4摄氏度下孵育48小时。

一抗孵育后,在洗涤缓冲液中洗涤3次,每次10分钟,然后在辣根过氧化物酶中孵育48小时,在洗涤缓冲液中稀释1至10。48小时后,将切片转移到PBS中10分钟,重复总共洗涤五次。洗涤后,将切片转移到 DAB 溶液中 7 分钟。然后,转移到含有0.02%过氧化氢的DAB溶液中10分钟。

经过

一系列洗涤后,将切片按数字顺序安装在显微镜载玻片上。让其干燥约 30 分钟。然后,将样品放入滑架中风干。接下来,将样品在含有蒸馏水的载玻片染色皿中重新水化 10 分钟。

然后,将载玻片转移到蒸馏水中的 0.02% 结晶紫中 15 分钟。重复结晶紫染色后,通过乙醇系列使切片重新水化。然后,在二甲苯中清除切片两次,每次 15 分钟。最后,加入快速干燥封片剂,并盖玻片。

24 小时后,载玻片可用于显微镜检查。首先将载玻片放在显微镜的电动载物台上,然后打开立体学软件,检查组织的厚度。在更换为 100 倍油浸物镜之前,使用低倍率物镜描绘感兴趣区域。

然后,在会计框架中选择一个特定点,例如,与角落相邻的区域,并通过沿焦平面移动来定位该部分的顶部,直到该部分的某些特征出现在焦点中。将此 z 位置注册为 0。接下来,将焦平面向下移动穿过组织,直到组织的最后一个 z 水平对焦,然后标记此位置。局部组织厚度定义为 0 到该终点,并且可以在 z 轴上读取。

记录组织厚度。在感兴趣区域内的几个地方测量组织厚度。解剖机和保护区的高度、计数的大小、步长框架和最终放大倍数在试点研究中确定。现在,您可以使用 60 倍油或 100 倍油物镜和高数值孔径,通常以 2,000 至 3,000 倍的最终放大倍数对 BrdU 阳性神经元进行计数。

在每个计数帧中识别 BrdU 阳性神经元,但不要计算那些接触红色排除线的神经元。计算那些接触绿色包涵体线的 BrdU 阳性神经元,以及那些落在计数框边界内的神经元。仅当在解剖器高度内清楚地识别出感兴趣的特征时,才计算 BrdU 阳性神经元。此处显示的半可见神经元不计算在内。

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Last updated: 18 July 2026