使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

取用溴脱氧尿苷（BrdU）——一种胸腺嘧啶核苷类似物——注射过的大鼠的海马脑切片。

BrdU 在细胞分裂期间整合到 DNA 中，标记齿状回内新生的神经元，该区域是神经发生部位。

加入氧化剂孵育，以灭活内源性过氧化物酶。

用酸处理以变性DNA并暴露BrdU，然后中和酸。

使用去垢剂孵育以通透细胞膜，并使用封闭液封闭非特异性结合位点。

使用靶向 BrdU 的一抗进行孵育，随后加入针对一抗的辣根过氧化物酶标记的二抗。

加入一种生色底物和一种氧化剂，使过氧化物酶将底物转化为有色产物。

将组织切片装片，并使用核酸结合染料进行复染。

脱水组织，然后进行处理以提高透明度。

在显微镜下，识别齿状回。

采用光学分馏器技术，分析贯穿组织厚度的多个层面，以定量BrdU标记的神经元。

准备开始免疫染色时，先将切片恢复至室温。然后使用画笔将一系列海马切片中每隔第五张的切片转移至置于盛有PBS的培养皿中的25孔染色网篮中。每个海马组织应有8至12张切片用于染色。将含有切片的染色网篮转移至盛有PBS的相应玻璃染色缸中，在PBS中清洗切片两次，每次10分钟。

然后，在3%过氧化氢中孵育20分钟。洗涤后，将切片依次通过三种盐酸溶液。随后，在0.1摩尔的四硼酸钠溶液中室温下中和20分钟。

在更换洗涤缓冲液后，每次孵育10分钟，共三次，随后将切片转移至封闭液中，在室温下封闭1小时。然后将切片在封闭液中按1:100比例稀释的小鼠抗BrdU抗体溶液中，于4摄氏度孵育48小时。

一抗孵育后，用洗涤缓冲液每次10分钟，洗涤三次，然后在洗涤缓冲液中按1:10稀释的辣根过氧化物酶中孵育48小时。48小时后，将切片转移至PBS中10分钟，并重复此步骤，共洗涤五次。洗涤后，将切片转移至DAB溶液中7分钟。随后，转移至含有0.02%过氧化氢的DAB溶液中10分钟。

经过一系列洗涤后，将切片按数字顺序贴附于显微镜载玻片上，静置干燥约30分钟。然后将样本放入载玻片架中进行风干。接着，将样本置于盛有蒸馏水的染色缸中，复水10分钟。

然后，将切片转移至蒸馏水中含0.02%结晶紫的溶液中染色15分钟。重复结晶紫染色后，通过梯度乙醇溶液对切片进行再水化。接着，用二甲苯透明处理切片两次，每次15分钟。最后，加入快速干燥封片剂，并盖上盖玻片。

24小时后，载玻片可用于显微镜观察。首先将载玻片放置在显微镜的电动载物台上，然后打开体视学软件，开始检查组织的厚度。先使用低倍物镜勾画出感兴趣区域，再切换至100倍油镜物镜。

然后，选择计数框中的一个特定位置，例如靠近角落的区域，通过沿焦平面移动，直到切片的某个特征清晰对焦，从而确定该切片的顶部位置。将此 z 位置记录为 0。接着，将焦平面逐渐向下移动穿过组织，直到组织的最底层 z 平面清晰对焦，标记此位置。局部组织厚度即定义为从 0 至该终点的距离，可在 z 轴上读取。

记录组织厚度。在感兴趣区域内多个位置测量组织厚度。在预实验中确定剖切器的高度和保护区域、计数框的尺寸、步长以及最终放大倍数。现在可以开始计数BrdU阳性神经元，通常使用60倍或100倍油镜物镜，结合高数值孔径，最终放大倍数为2,000至3,000倍。

在每个计数框内识别 BrdU 阳性神经元，但不计数接触红色排除线的细胞。计数接触绿色包含线以及位于计数框边界内的 BrdU 阳性神经元。仅当目标特征在体视学高度范围内清晰可辨时，才进行 BrdU 阳性神经元的计数。此处显示的半可见神经元不予计数。