活体成像的 果蝇 使用荧光显微镜观察蛹眼

从一只眼睛暴露的转基因 Drosophila 蛹开始。

将蛹放置在湿润纸框内的水凝胶珠上，并用一圈水凝胶环绕。

蛹眼包含带有GFP标签的连接蛋白，可突出显示发育中眼神经上皮的细胞边界。

轻轻将盖玻片压在蛹眼区域。

在荧光显微镜下，GFP标记的连接处发出荧光，显示出神经上皮的组织结构。

以不同深度定期采集图像，并对图像进行处理以增强对比度并最大限度降低背景噪声。

将这些图像按时间间隔递增的顺序排列，以追踪神经上皮的发育过程。

最初，初级细胞在感光细胞簇周围形成边界，而小眼间细胞（ICs）则排列成单层结构。

随后，内核细胞在感光细胞附近分化为二级和三级细胞。

最后，通过程序性细胞死亡去除多余的晶状体细胞，形成六边形晶格，从而构建出有序的眼部结构。

使用镊子小心提起并移除卵盖，以暴露蛹的头部。接着，沿蛹壳侧面撕开，暴露单眼周围区域。轻柔地将蛹从粘性胶带上取下。

用吸水纸制作一个 15 平方毫米的小框，并在其中央打一个 5 毫米的孔。将该纸框浸入蒸馏水中，然后置于显微镜载玻片的中央。使用 30 毫升注射器挤出一圈均匀的凡士林，围绕在吸水纸框的周围。

接下来，将少量凡士林直接涂抹在载玻片上。小心地将蛹侧置，并用凡士林小滴加以固定。将盖玻片置于凡士林环上，使其接触眼上方的上皮组织。轻轻按压样本，使盖玻片与凡士林密封，并在瞳孔眼区域与盖玻片之间形成一个微小而平整的接触面。

使用荧光显微镜对蛹期样本进行成像。每隔七分钟，在黏附连接区域对眼神经上皮顶端区域进行连续光学切片扫描。采用适当的去卷积软件以降低背景信号，并增强连续切片图像的对比度。

对于 LAS AF 软件中的每个 z 轴层叠文件，进入工具面板，选择 3D 去卷积功能，然后点击应用。对每个去卷积后的层叠文件生成最大投影图像（MP 图像）。使用 Photoshop CS5 中内置的算法，对每个 MP 图像进行对齐，以突出显示单个细胞的行为，并减少由生物体生长引起的干扰。

从主菜单的“文件”选项卡中，打开“脚本”，然后选择“将文件加载为堆栈”。接下来，将多光子（MP）图像文件导入到“加载图层”面板中。请确保不要选中“尝试自动对齐源图像”选项，否则图像数据可能会发生畸变。当所有 MP 文件都加载到图层面板后，请检查所有图像是否按时间顺序排列，并确认最早的时间点位于图层堆栈的顶部。如有需要，可通过拖放方式调整图像顺序，直至正确排列为止。

然后选择自动对齐图层。选择“重新定位”，然后单击“确定”。