使用荧光显微镜对果蝇 Pupal 眼进行实时成像

从眼睛裸露的转基因果蝇蛹开始。

将蛹放在水合纸框内的果冻珠上，周围环绕着果冻环。

蛹的眼睛含有 GFP 标记的连接蛋白，可突出发育中眼睛神经上皮细胞中的细胞边界。

将盖玻片轻轻按在蛹眼区域。

荧光显微镜下，GFP 标记的连接发出荧光，显示神经上皮组织。

不同深度定期拍摄图像并处理图像以增强对比度并最大限度地减少背景噪声。

这些图像与增加的时间间隔对齐，以跟踪发育中的神经上皮。

最初，原代细胞在感光细胞簇周围形成边界，而间细胞或 IC 排列成单层。

后来，IC 在感光器附近分化为次级细胞和三级细胞。

最后，通过程序性细胞死亡去除多余的 IC，形成构建有组织的眼睛的六边形晶格。

使用镊子小心地提起并取出鳃盖，露出蛹头。接下来，沿着蛹壳的侧面撕开，露出一只眼睛周围的区域。轻轻地从胶带上取下蛹。

用吸墨纸构建一个 15 平方毫米的小框架，并在中间打一个 5 毫米的孔。将框架浸入蒸馏水中，并将其放在显微镜载玻片的中心。用 30 cc 注射器挤出一圈均匀的凡士林，围绕吸墨纸框架。

接下来，将一小粒凡士林直接添加到载玻片上。小心地将蛹侧卧，并用凡士林珠支撑它。在凡士林环的顶部放置盖玻片，使其接触眼睛上方的上皮细胞。轻轻压缩制剂，将盖玻片密封在凡士林上，并在瞳孔眼区域和盖玻片之间产生一个小而平坦的接触面。

使用荧光显微镜对蛹制剂进行成像。每七分钟通过粘附连接区域的眼神经上皮顶端结构域捕获连续切片。使用适当的反卷积软件来减少背景并增强串行部分图像的对比度。

对于 LAS AF 软件中的每个 z 堆栈文件，导航到"工具"面板，选择"3D 反卷积"，然后单击"应用"。为每个反卷积堆栈文件生成最大投影或 MP 图像。使用 Photoshop CS5 中的内置算法对齐每个 MP 图像以突出单个细胞行为并减少生物体生长引起的干扰。

从主菜单的 文件（File） 选项卡中，打开 脚本（Scripts），然后选择 将文件加载到堆栈中（Load Files into Stack）。接下来，将 MP 图像文件导入到加载图层面板中。确保未选择"尝试自动对齐源图像"选项，否则图像数据可能会失真。将所有 MP 文件加载到图层窗格后，检查所有图像是否按时间顺序排列，并且最早的时间点是否位于图层堆栈的顶部。如果需要，拖放它们，直到正确排序。

然后选择"自动对齐图层"。选择"重新定位"，然后单击"确定"。