使用荧光显微镜研究硬脑膜感觉神经元的起源

取一只颅骨暴露并覆盖有手术巾的麻醉大鼠。

钻孔暴露硬脑膜（dura mater），即大脑的最外层，由来自三叉神经节和颈段背根神经节的痛觉敏感感觉神经元支配。

构建屏障以防止泄漏，注入逆行示踪剂，并封闭孔洞。

缝合伤口，并让大鼠恢复。

示踪剂进入感觉神经元的轴突，逆行运输至其神经节，并进入神经元胞体。

处死大鼠并解剖神经节。

制备神经节切片并将其固定在载玻片上。

加入溶液以通透细胞膜并封闭非特异性结合位点。

使用靶向示踪剂和感觉神经元特异性神经肽的一抗进行孵育。

加入针对一抗的荧光标记二抗。

利用荧光显微镜观察神经肽与示踪剂在细胞体内的共定位，以确认感觉神经元的神经节来源。

使用电动剃刀剃除大鼠头部的毛发。然后将钝性耳杆插入大鼠耳道，并将其固定于立体定位仪上。调整鼻部固定装置，并在眼睛表面涂抹眼用软膏。使用75%乙醇清洁头部手术区域的皮肤，沿头皮正中线做一切口。

使用无菌棉签钝性剥离颅骨上的骨膜和肌肉组织。在左侧顶骨和颞骨的脑膜中动脉上方区域，用圆头钻针的磨钻钻出一个小孔。用牙科硅酸盐水泥在孔周围构建一个围堰，然后用10微升微量注射器将2微升荧光金注入脑膜中动脉周围的小孔内。

用一小块止血海绵覆盖孔洞。在孔洞上放置一片石蜡膜，并用骨蜡密封边缘。使用无菌缝合线缝合伤口。将大鼠置于温暖环境中，直至其完全恢复，然后将其放回笼中。

在存活7天后，用0.9%生理盐水灌注这些大鼠，随后用0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛进行灌注。分离三叉神经节（TG）以及颈段1至4的背根神经节（DRGs），然后在恒冷切片机系统上沿矢状方向切成30微米厚的切片。将切片贴附于硅烷涂层的玻璃载片上。

用组织化学笔圈出组织区域，加入封闭液中于室温孵育30分钟。将样本转移至含兔抗氟金抗体和小鼠抗CGRP抗体的溶液中，于4摄氏度孵育过夜。

第二天，用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液将切片洗涤三次。将洗涤后的切片置于驴抗兔 Alexa Fluor 594 与驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 二抗混合溶液中孵育。随后，再用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液洗涤三次。用 50% 甘油封片后进行观察。在紫外光照下，使用荧光显微镜拍摄三叉神经节（TG）和背根神经节（DRGs）中荧光金标记神经元的图像。然后，采集 TG 和 DRGs 中荧光金与降钙素基因相关肽（CGRP）共标记神经元的图像。