小鼠结肠肌间神经丛肠道神经元和神经胶质细胞活动的钙成像

以一个装有固定小鼠结肠肌丛组织的成像室为例，该室容纳由肠神经元和神经胶质细胞网络组成的神经节丛。

这些细胞用钙指示剂标记，钙结合时发出荧光。

接下来，将腔室放在荧光显微镜载物台上。用含有抑制剂的预热缓冲液灌注腔室，以抑制成像过程中的肌肉收缩。

使用显微镜识别表现出均匀荧光的健康神经节区域。

获取荧光图像以测量基线活性，为细胞内钙水平提供参考。

用受体激动剂灌注组织以激活神经元受体，从而触发细胞内钙流入和荧光强度增加。

神经元激活间接刺激周围的神经胶质细胞，导致钙流入和随后荧光增加。

捕获延时荧光图像以测量荧光强度的变化，这表明神经元和神经胶质细胞相对于基线水平的钙动力学和信号传导活性。

孵育过程中，根据方案书面部分的说明制作改良的克雷布缓冲液，并添加3微摩尔尼卡地平和1微摩尔东莨菪碱，以抑制钙2加全安装解剖成像期间的肌肉收缩。将记录室放置在荧光显微镜下，并使用带有多个加热注射器储液器的重力流灌注系统，建立每分钟 2 至 3 毫升的 37 摄氏度克雷布缓冲液的连续灌注速率。确保防止在连接到真空疏水阀的吸入管线中形成气泡。在明场照明下将所需的神经丛聚焦。避免过度曝光组织，这可能导致光漂白。

检查神经节内的荧光团载量并选择健康的神经节进行成像。不健康的受损神经节会表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。选择神经节后，将光路转移到相机并使用图像采集软件获得实时图像。确保神经节对焦并设置图像采集速率和曝光时间。

图像采集速率和时间将根据调查人员希望记录的事件而有所不同。对于大多数实验，传统上神经胶质细胞的图像采集速度为 0.5 至 1 赫兹，神经元的图像获取速度高达 2 至 10 赫兹，因为神经胶质钙瞬变不如钙瞬态神经元快。

开始记录并在没有实验刺激的情况下建立所选神经节的基线生理活动 30 秒。然后，根据药物的优化方案，使用重力流灌注系统以每分钟 2 至 3 毫升的速度应用预热的感兴趣药物，例如受体激动剂和拮抗剂。停止录制并查看实验的延时视频。

使用适当的图像分析软件仔细选择感兴趣区域或 ROI。

最后，使用适当的成像软件对感兴趣区域的荧光强度进行归一化并将其与其初始基线值进行比较。归一化荧光的变化与钙的变化成正比。