Name: 在极少数情况下，表皮转谷氨酰胺酶IgA和组织转谷氨酰胺酶2抗体的识别恒河猴皮炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 了解如何利用免疫荧光染色技术可视化恒河猴疱疹样皮炎皮肤中的自身免疫反应。该方法通过检测IgA抗体与表皮转谷氨酰胺酶的沉积，为研究麸质敏感相关的自身免疫性皮肤病机制提供了重要的动物模型。

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作者谨此感谢Amanda Tardo、Mostafa Bouljihad博士、Stephanie Feely、Carol Coyne、Erin Ribka博士、Pete Didier博士以及Dorothy Kuebler提供的技术协助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01-DK076653和3R01-DK076653-02S1（授予K.S.），以及TNPRC基础运营资助项目RR000164。

1. 皮肤活检样本采集
<ol>
	<li>在进行皮肤活检操作前，通过肌肉注射给予动物盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮混合物（Telazol，Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，IA），剂量为2.5 mg/kg。从麻醉给药开始监测动物，直至其进入卧倒状态，然后将其从饲养笼中移出。</li>
	<li>使用Oster Golden A5单速兽用剪毛器（配备40号刀头，Oster Professional Products，McMinnville，TN）去除目标皮肤区域的毛发，并用聚维酮碘溶液与酒精交替进行无菌准备。在选定的活检部位覆盖无菌带孔洞巾。</li>
	<li>采用无菌技术，将4.0 mm Miltex皮肤穿刺活检器械（Miltex，York，PA）置于皮肤表面，同时施加轻微压力，顺时针和逆时针各旋转180度，直至活检钻头穿透真皮层进入皮下组织。取出活检样本后，用镊子夹住被切断的皮肤部分，并将其与皮下组织分离。</li>
	<li>使用带有3/8圆形切割针的3-0尼龙缝线（Ethilon，Ethicon，Johnson &amp; Johnson Medical Limited，Berkshire，UK）以十字交叉方式缝合皮肤缺损。所有动物术后均通过肌肉注射给予0.01 mg/kg盐酸丁丙诺啡（Hospira，Lake Forest，IL）以提供镇痛。</li>
</ol>
2. 样品处理
<ol>
	<li>使用慢性皮炎及健康对照恒河猴的皮肤活检样本。从每只动物获取两到三个（直径4 mm）活检样本。</li>
	<li>将第一个样本置于锌福尔马林固定液（Z-fix，Anatech Ltd.，Battle Creek, MI）中固定24小时，用水清洗30分钟，再用70%乙醇短暂清洗，随后放入Leica ASP300组织脱水机（Leica Microsystems Inc.，Buffalo Grove, KS）中进行脱水处理，依次使用70%、80%、95%和100%乙醇（Fisher Scientific，Pittsburgh, PA）各脱水48分钟，接着用二甲苯（Fisher）更换两次。</li>
	<li>用石蜡介质（Fisher）包埋，以室温长期保存。切片前于-20°C放置20分钟。使用旋转式切片机（HM325，Microm International，Waldorf, Germany）制备6 μm厚的切片。将切片置于带电荷的载玻片（Fisher）上，并在60°C下空气干燥过夜。采用苏木精-伊红（H&amp;E）常规染色法染色（如下所述）。</li>
	<li>将第二个样本在2%多聚甲醛（USB Corp，Cleveland, OH）中室温固定30分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco-Invitrogen，Carlsbad, CA）洗涤三次，放入30%蔗糖（Fisher）中4小时，随后包埋于OCT冷冻包埋剂（Sakura Finetek，Torrence, CA）中。切片前于-80°C保存20分钟。使用冷冻切片机（HM560，Thermo Scientific，Kalamazoo, MI）制备15 μm厚的切片。</li>
</ol>
3. H&amp;E 染色
<ol>
	<li>使用二甲苯（Fisher）分三次脱蜡，然后通过梯度乙醇复水：100% 乙醇三次，每次 2 分钟；95% 乙醇两次，每次 2 分钟；80% 乙醇一次，2 分钟；最后用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>用苏木精（Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI）染色 1 分钟，随后用流动自来水短暂冲洗。</li>
	<li>用伊红（Sigma）复染 6 分钟。</li>
	<li>将染色组织通过 95% 乙醇和无水乙醇脱水，各两次，每次 2 分钟，然后在二甲苯中透明三次，每次 3 分钟。</li>
	<li>使用 Cytoseal 封片介质（Richard-Allan Scientific）对 H&amp;E 染色的组织切片进行封片。</li>
</ol>
4. 组织病理学评估
使用4至40倍放大倍数的光学显微镜和配备SPOT Insight数码相机（Digital Instruments Inc.，密歇根州，美国）的Leica显微镜，检查经H&amp;E染色的皮肤活检切片。
5. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>使用OCT包埋的皮肤切片进行免疫荧光染色。染色前，在含有0.2%鱼皮明胶（FSG，Sigma）和0.1%Triton X-100（Sigma）的PBS中浸泡20分钟，以去除OCT并通透组织。</li>
	<li>洗涤载玻片后，在湿润的载玻片盒中，用PBS-FSG稀释的10%正常山羊血清（NGS，Sigma）于室温孵育1小时。</li>
	<li>为观察IgA和tTG2抗体的沉积情况，将载玻片与抗恒河猴IgA和tTG2一抗在含10% NGS的PBS-FSG中按1:1000稀释后孵育1小时。</li>
	<li>用PBS–FSG–Triton X-100（Sigma）洗涤10分钟，再用PBS-FSG洗涤10分钟。</li>
	<li>加入偶联Alexa Fluor荧光染料488（绿色）、568（红色）或633（蓝色）（Molecular Probes-Invitrogen）的二抗（针对同种型特异性抗体），按1:1,000稀释比例进行孵育。使用ToPro-3染料标记细胞核DNA。抗体稀释液使用含10% NGS的PBS-FSG。</li>
	<li>使用抗淬灭封片液（Sigma）封片，以固定染色后的组织切片。</li>
</ol>
6. 共聚焦成像
使用配备三种激光器（共六条激发谱线可用）的 Leica TCS SP2 真共聚焦激光扫描显微镜（Leica，德国韦茨拉尔）进行成像：488 nm 氩-氪激光（绿色）、568 nm 氪激光（红色）和 633 nm 氦-氖激光（蓝色），覆盖可见光至远红光谱范围。采集微分干涉差（DIC）图像以评估未标记组织的结构。
7. 代表性结果
图3A展示了eTG被tTG2和IgA抗体共同阳性识别的一个示例。与人类患者的情况一致，由于在恒河猴中，类似疱疹样皮炎（DH）的皮肤病发病率远低于类似乳糜泻（CD）的谷蛋白敏感性，因此大多数皮肤活检样本预期会显示与tTG2抗体呈阳性反应，但不存在tTG2+IgA+双阳性细胞（图4）。这些与DH无关的病例（包括微生物来源的皮炎病例）会在上皮下方显示出一些散在的单阳性IgA+细胞，但tTG2和IgA标记物之间无光谱重叠（图3B和图4）。因此，必须遵循建议的检测流程顺序：首先进行临床检查（图1），然后进行组织病理学评估（图2）；只有在无法确定其他更常见的皮炎致病因素时，才建议对皮肤活检组织进行tTG2和IgA染色的共聚焦显微镜检查。仅凭临床或组织病理学评估不足以对该疾病做出阳性诊断。当在真皮乳头区域周围发现双阳性（tTG2+IgA+）细胞时，方可诊断为类似DH的皮炎。在此类情况下，建议去除饮食中的谷蛋白并采用无谷蛋白饮食，以缓解皮炎症状。
<img alt="皮肤刺激比较；并排图像显示不同严重程度，皮肤病学研究。" src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1. EM96猕猴在停止膳食 gluten 5周前（A）和停止后（B）的腹股沟区域。重新引入膳食 gluten 后，皮炎再次出现（C）。
<img alt="组织学切片分析、皮肤组织病理学、细胞结构比较、显微图像。" src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. EM96 恒河猴在停止摄入膳食麸质前（A）和停止后 9 周（B）采集的皮肤活检组织的苏木精-伊红（HE）染色结果。A：上皮增厚（7–15 层上皮细胞），表面有大量角化过度细胞形成的厚层痂壳，其中浸润有变性中性粒细胞；中性粒细胞也可见于上皮内，并与真皮上层附属器周围中等数量的淋巴细胞、浆细胞和组织细胞混合存在。B：仍存在部分角化过度，但上皮厚度已恢复正常（4–7 层），真皮上层淋巴浆细胞浸润极少。C：作为对照，显示来自 FR56 恒河猴的正常腹部皮肤，无淋巴浆细胞浸润。放大倍数 20×。
<img alt="显示IgA、TG2和细胞核染色的皮肤组织免疫荧光显微镜图像；示意图。" src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. EM96恒河猴皮肤活检组织在无麸质饮食干预前（A）和干预9周后（B）的共聚焦显微镜图像。A：IgA染色（绿色）、tTG2（红色）和ToPro-3细胞核DNA标记物（蓝色）。IgA与tTG2在真皮乳头区域周围共定位，呈现黄色。B：无麸质饮食9周后采集的皮肤样本显示上皮内无IgA沉积，但基底上皮下仍可见少量IgA（绿色），tTG2（红色）和ToPro-3细胞核DNA标记物（蓝色）。
<img alt="组织学切片、组织结构的荧光显微镜图像、细胞分布分析。" src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 采集自表现出慢性（非 DH 相关）皮炎症状的 GI24 恒河猴皮肤活检组织的共聚焦显微镜图像。IgA 染色呈绿色，tTG2 呈红色，ToPro-3 核 DNA 标记呈蓝色。tTG2+ 细胞位于上皮内，少量 IgA+ 细胞位于上皮下方，而红色与绿色标记之间未见明显的光谱重叠。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>动物标记</td>
			<td>性别 
			[男/女]</td>
			<td>年龄 
			[年份]</td>
			<td>临床症状</td>
			<td>血浆tTG2 
			抗体</td>
			<td>饮食 
			[1,2]*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HJ71</td>
			<td>F</td>
			<td>1.3</td>
			<td>健康</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HD13</td>
			<td>M</td>
			<td>1.4</td>
			<td>健康，偶发腹泻</td>
			<td>+</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FR56</td>
			<td>M</td>
			<td>5.4</td>
			<td>慢性特发性腹泻</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM96</td>
			<td>F</td>
			<td>5.0</td>
			<td>慢性皮炎</td>
			<td>±（临界）</td>
			<td>1 和 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI24</td>
			<td>F</td>
			<td>4.6</td>
			<td>慢性皮炎</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于采集皮肤活检样本的TNPRC恒河猴
* 饮食1 – 普通猴粮（含麸质）；饮食2 – 无麸质饮食

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们新建立的非人灵长类动物麸质敏感模型最近被用于研究饮食中的麸质所引发的肠道通透性变化5,6。在一些对麸质敏感的猕猴中，检测到了血浆中的tTG2抗体以及肠道内tTG2+IgA+沉积物。由于我们近期在圈养的恒河猴中发现了罕见的特发性皮炎病例，且无法确定常见的（感染性/代谢性）病因，因此本研究的目的是评估在这些罕见皮炎病例的皮肤样本中是否可检测到tTG2+IgA+抗体沉积（表1）。
提示乳糜泻（CD）的tTG2自身抗体的流行率在1:70至1:200之间7。我们对麸质敏感性猕猴的研究表明，圈养恒河猴中tTG2抗体的流行率与人类群体中报道的相似。然而，可能影响人类和猕猴中此类流行程度的主要环境和遗传因素尚未得到充分研究8,9。导致疱疹样皮炎（DH）的流行率（1:400至1:10,000）低于CD的相关因素也尚不清楚。因此，需要更深入的研究来探讨CD和DH的发病机制。本报告首次证明了非人灵长类动物中存在类似DH的皮炎。尽管在猕猴中，类似DH的皮炎流行率似乎远低于麸质敏感性肠病，但本研究结果为未来研究提供了希望，前提是能够发现更...

<table><tbody><tr><td>抗人 IgA-FITC *</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5259</td><td>1:100 工作稀释度</td></tr><tr><td>抗人 tTG2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>MS-300-P1ABX</td><td>1:100 工作稀释度</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG1 **</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td>1:1,000 工作稀释度</td></tr><tr><td>ToPro-3 DNA 探针 ***</td><td>Invitrogen</td><td>T-3605</td><td>1:1,000 工作稀释度</td></tr><tr><td>锌福尔马林 (Z-fix)</td><td>Anatech Ltd., Battle Creek, MI</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>OCT 冷冻包埋介质</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 封片介质</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>抗淬灭溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 3130</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon（尼龙缝线）</td><td>Ethicon Inc.</td><td>663G</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 皮肤活检打孔器</td><td>Miltex Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oster Golden A5 单速兽用剪毛器，配40号刀头</td><td>Oster Professional Products</td><td>78005-050</td><td></td></tr><tr><td>Leica 组织脱水机</td><td>Leica Microsystems</td><td>ASP300</td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>Microm International</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HM560</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica, Wetzlar</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 异硫氰酸荧光素&lt;br/&gt; ** 在 tTG2 一抗之后使用的二抗（Alexa Fluor 568 标记）&lt;br/&gt; *** 染料</td></tr></tbody></table>

一例罕见的rhesus皮炎中iga抗体及组织转谷氨酰胺酶2抗体对表皮转谷氨酰胺酶的识别

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

组织转谷氨酰胺酶2（tTG2）是一种肠道消化酶，能够使已部分消化的膳食麸质（如麦胶蛋白肽）发生脱酰胺化。在具有遗传易感性的个体中，tTG2会引发自身免疫反应，其特征是产生针对tTG2的抗体，并直接沉积于小肠壁1,2。此类抗体的存在是乳糜泻（CD）的主要标志之一。表皮转谷氨酰胺酶（eTG）是转谷氨酰胺酶家族中的另一个成员，在少数乳糜泻患者中也可作为自身抗原发挥作用。在这些相对罕见的病例中，eTG引发一种自身免疫反应（表现为皮肤皮疹），临床上称为疱疹样皮炎（DH）。尽管乳糜泻和疱疹样皮炎的发病机制尚未完全明确，但已知tTG2与eTG具有共同的抗原表位，可被乳糜泻和疱疹样皮炎患者的血清抗体所识别3,4。
本研究采用共聚焦显微镜检查两只患有皮炎的食蟹猴（Macaca mulatta）皮肤病变的活检样本（表1、图1和图2），以分析受累组织。其中一只动物（EM96）显示出IgA与tTG2抗体的光谱重叠（图3）。双阳性tTG2+IgA+细胞主要分布于表皮深层及真皮乳头周围区域，这与疱疹样皮炎（DH）患者中所描述的病变一致3。当EM96动物转入无麸质饮食后，皮炎症状以及tTG2+IgA+沉积物均消失且无法再被检测到（图1-3）。然而，在重新引入膳食麸质后，EM96的皮炎再次出现（未显示）。在其他食蟹猴（包括患有非相关性皮炎的动物）中，均未检测到tTG2+IgA+沉积物。EM96动物在无麸质饮食下皮炎缓解，同时其皮肤中存在tTG2+IgA+细胞，提示该病症的发病机制具有自身免疫性，类似于疱疹样皮炎。这是首次在非人灵长类动物中报道类似疱疹样皮炎的皮肤病变。

疱疹样皮炎（DH）是一种慢性炎症性疾病，其特征是IgA与表皮转谷氨酰胺酶（eTG）之间发生自身免疫反应。DH仅在极少数对麸质敏感和/或患有乳糜泻的患者中发生。本研究结果表明，DH也可能在患有特发性皮炎症状的恒河猴宿主中发生。

一例罕见的Rhesus皮炎中IgA抗体及组织转谷氨酰胺酶2抗体对表皮转谷氨酰胺酶的识别

组织转谷氨酰胺酶2（tTG2）是一种肠道消化酶，可使已部分消化的膳食麸质（如麦胶蛋白肽）发生脱酰胺作用。在……

本视频文章展示了一种用于可视化谷蛋白敏感性雷斯·麦卡斯（Reeses Maccas）伴有疱疹样皮炎时皮肤中自身免疫反应的方法。该方法首先识别出患有皮炎但无法归因于其他更常见诊断病因的动物，并将其与年龄匹配的健康对照个体中的特发性病例进行区分。从病变区域获取皮肤样本，以评估组织结构、炎症情况以及表皮转谷氨酰胺酶的存在。采集的自身抗体样本采用锌福尔马林固定，或用2%戊二醛-伊红（EOSIN）或HNE固定。随后进行染色，以评估炎症程度和组织病理学特征；同时进行免疫荧光染色，以检测表皮转谷氨酰胺酶自身抗体在表皮深层的沉积情况。疱疹样皮炎是一种慢性炎症性疾病，其特征为IgA与表皮转谷氨酰胺酶之间的自身免疫反应。疱疹样皮炎仅在极少数对麸质敏感的乳糜泻患者中发生。本研究结果表明，疱疹样皮炎也可能在少量对麸质敏感的恒河猴中发生。我们的结果证实了近期开发的 Resus Meac 肌肉萎缩模型在呈现谷蛋白敏感性方面的有效性。结果显示，该病症的临床表现不仅局限于小肠。典型实验方案包括一只患有特发性皮炎的动物和一只年龄匹配的健康对照动物。采用无菌技术进行适当的麻醉和部位准备后，将4.0毫米Miltex打孔式皮肤活检器械置于动物皮肤表面，轻轻施加压力。顺时针和逆时针各旋转180度，直至活检针穿透真皮层进入皮下组织。使用镊子重复上述操作，进行第二次活检。抓住已横断的皮肤部分，并将其从皮下组织中分离。将第一个用于苏木精-伊红染色处理的样本置于锌福尔马林中。然后使用3/8圆弧切割针和3-0尼龙缝线，将第二个用于免疫荧光显微镜检测的样本置于2%多聚甲醛中。以十字交叉方式缝合皮肤缺损。重复此过程，从每只动物获取两到三个活检样本。根据书面方案中详细描述的方法给予术后镇痛，以检测IgA和TTG的表达及定位情况。首先将样品在室温下置于2%多聚甲醛中孵育4小时，以完成固定。去除多聚甲醛后，在摇床上用PBS洗涤30至60分钟。重复此步骤两次，共进行三次洗涤。然后吸除PBS，并加入30%蔗糖，孵育至少4小时，最长可至两周。接下来，将样品置于OCT冷冻包埋剂中，并浸入装有异戊烷和干冰的容器中，直至透明的OCT变为完全不透明的白色，表明其已完全冻结。然后将组织块置于–80 °C环境中至少20分钟。此步骤可确保组织彻底冻结，从而使切片刀能够顺利切割组织而不会造成压碎。 组织可在 OCT 中于 -80 摄氏度长期保存。切片并将其贴附到载玻片上后，需去除 OCT 并对组织进行通透处理。将载玻片浸入含有 PBS、0.2% 鱼皮明胶和 0.1% Triton X-100 的 Copeland 染色缸中。然后将玻片置于摇床上作用20分钟；20分钟后，用含0.2%鱼皮明胶的PBS洗涤玻片10分钟，接着在湿盒中于室温下用含0.2%鱼皮明胶的PBS稀释的10%正常山羊血清孵育40分钟。将玻片分别与抗恒河猴IgA抗体和TTG两种一抗各自孵育1小时。接下来，用手握住玻片边缘，使用移液管轻轻加入含Triton X-100的P-B-S-F-S-G溶液冲洗玻片。然后将其放入含有相同缓冲液的考普兰德瓶中，将瓶子置于摇床上孵育10分钟。重复洗涤一次。然后用 P-B-S-F-S-G 洗涤 10 分钟。随后孵育 40 分钟，使用针对一抗来源物种的 Alexa Fluor 标记的同型特异性二抗。再次按前述方法洗涤玻片。然后将核DNA染料以1:2000的稀释比例加入抗淬灭封片剂中。将一滴封片剂直接滴加到每张载玻片上。然后用盖玻片覆盖组织，并用指甲油封固。将载玻片置于暗处，使其自然干燥。为观察IgA和TTG的双重染色，使用配备有适合检测所用二抗的激光器的共聚焦激光扫描显微镜进行成像，以评估未标记组织记录。差分干涉对比（DIC）图像。DIC 是显微镜中的一个通道，可在灰度上分辨组织，从而更准确地判断细胞结构，以进行 HNE 染色。置于锌福尔马林中的样本首先用石蜡包埋，并切片至载玻片上。然后将载玻片在60摄氏度下烘烤过夜，并放入自动染色机中，当染色完成后，用HNE对载玻片进行染色。使用配备数码相机的光学显微镜，在Forex和40倍放大倍数下检查染色后的活检切片。对每种放大倍数记录三到四张图像。本研究中所用的猕猴皮肤病变活检样本按照本视频所述方法进行采集和染色，以研究无麸质饮食对皮炎的影响。显示了一只猕猴在撤除饮食中的麸质前的腹股沟区域。当该动物转入无麸质饮食后，皮炎消失，不再可检测到，如此处所示。在重新引入饮食中的麸质后，皮炎再次出现，以评估组织结构。在撤除麸质之前进行了苏木精和伊红染色。上皮增厚，由7至15层上皮细胞组成，表面覆盖一层较厚的角化过度细胞层，其中浸润有变性中性粒细胞。在饮食中撤除麸质9周后，中性粒细胞也出现在上皮内，并与真皮上层附属器周围中等数量的淋巴细胞、浆细胞和组织细胞混合存在。尽管仍存在一些角化过度和增厚的上皮，但与之前相比，真皮上层仅见极轻微的淋巴浆细胞浸润。此处显示的是正常的腹部皮肤，无上皮增厚，且真皮上层无淋巴浆细胞浸润。在无麸质饮食撤除前采集的相同猕猴皮肤活检样本的共聚焦显微镜图像中，绿色显示IgA，红色显示转谷氨酰胺酶2（tTG2），二者在真皮乳头区域周围共定位呈现黄色，表明存在针对表皮转谷氨酰胺酶的自身抗体。无麸质饮食九周后，to pro three 核DNA标记呈蓝色。上皮内已不再观察到IgA，表明针对表皮转谷氨酰胺酶的自身抗体（应呈黄色）缺失。部分基底膜下IgA（呈绿色）仍存在。在其他猕猴中，to pro three 核DNA标记也呈蓝色，包括一只患有无关特发性皮炎的动物。未检测到自身抗体。IGA染色呈绿色，ttg two呈红色，细胞核DNA标记物呈蓝色。ttg two阳性细胞存在于上皮层内。上皮下方可见少量 IGA 阳性细胞。由于红色与绿色标记物之间未见明显的光谱重叠，表明不存在针对表皮转谷氨酰胺酶的自身抗体。本研究中，我们采用共聚焦显微镜观察针对表皮转谷氨酰胺酶的 IGA 自身抗体的存在情况。在进行该操作时，需要牢记大多数皮炎病例并非由麸质敏感引起。因此，应先进行其他检测方法，包括血清抗麦胶蛋白抗体、抗组织转谷氨酰胺酶抗体检测以及仔细的临床评估。尽管如此，疱疹样皮炎的发病率仍低于麸质敏感性肠病的发病率。研究结果为未来的研究提供了基础，前提是将能发现更多患有此疾病的动物。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

本文介绍了一种基于微流控芯片化学发光系统的血清特异性免疫球蛋白E检测方法，并评估了其在过敏诊断中的应用价值。...

生物芯片微流控技术在血清特异性免疫球蛋白E（sIgE）过敏原检测中的应用

本文介绍了一种分离表皮与真皮以评估炎症介质产生的实验方案。在发生炎症后，利用嗜热菌蛋白酶在 4 °C 条件下将大鼠后足掌的表皮与真皮分离。分离所得的表皮可用于通过 RT-PCR 进行 mRNA...

利用嗜热菌蛋白酶分离大鼠表皮与真皮以检测部位特异性炎症相关mRNA和蛋白质

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iNKT细胞在葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中的过继免疫治疗

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一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

本方案描述了一种简便的方法，可重复且稳定地培养三维重建人表皮。此外，还对表皮屏障模型的结构-功能关系进行了表征。同时展示了重建人表皮在受到促炎刺激后的生物学反应。...

大规模培养三维重建人表皮

皮肤病变在许多风湿性疾病中常见且具有重要意义，活检结合病理学分析在诊断中起着关键作用。本文详细概述了标准化的皮肤活检操作流程，并以盘状红斑狼疮为例，强调了皮肤病理学在诊断风湿性疾病中的重要作用。...

皮肤活检在盘状红斑狼疮诊断中的应用

了解如何利用免疫荧光染色技术可视化恒河猴疱疹样皮炎皮肤中的自身免疫反应。该方法通过检测IgA抗体与表皮转谷氨酰胺酶的沉积，为研究麸质敏感相关的自身免疫性皮肤病机制提供了重要的动物模型。

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