小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

取一块载玻片，其上培养有源自小鼠胚胎的腹侧中脑神经元。

利用病毒载体感染细胞以表达钙指示剂。

将盖玻片转移至共聚焦显微镜的记录室中，该记录室灌注有记录缓冲液。

利用可见光识别包含多个神经元的区域，然后切换至荧光成像。

在细胞内钙离子浓度较低时，指示剂保持未结合状态，荧光强度较弱。

神经元的固有特性可产生自发性动作电位，从而触发电压门控钙通道开放，引起钙离子内流。

过量的钙离子与指示剂结合，诱导构象变化，从而增强荧光强度。

记录荧光强度随时间的变化，以追踪自发性钙活动。

引入高浓度的神经递质，使其与神经元上的受体结合，从而产生持续的动作电位。

持续的电压门控钙通道激活延长了钙离子内流，导致荧光强度持续增加。

根据文稿说明，配制 1 升 HEPES 记录缓冲液、200 毫升 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲液和 200 毫升 10 微摩尔 NBQX 记录缓冲液。向一个无菌毫米级培养皿中加入 3 毫升记录缓冲液。

从培养箱中取出带有感染培养物的培养皿，然后用尖头镊子小心夹住一张盖玻片的边缘，将其转移至含有记录缓冲液的培养皿中。将剩余的盖玻片放回培养基中，并重新放入37°C培养箱内，随后将含有记录缓冲液的培养皿运送至共聚焦显微镜处。

启动成像软件。在软件初始化的同时，启动蠕动泵并将管路放入记录缓冲液中。随后将流速校准至 2 毫升每分钟。用精细镊子将感染的盖玻片从培养皿转移至记录浴槽中。使用 10 倍水浸物镜和明场照明，找到焦平面，并寻找神经元胞体密度较高的区域。然后切换至 40 倍物镜并重新对焦样品。

在染料列表窗口中选择并应用 Alexa Fluor 488。为防止荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于 Alexa Fluor 488 通道，将高压（HV）设为 500，增益设为 1x，偏移设为零。将 488 激光线的功率设为 5%，将针孔尺寸增大至 300 微米，并使用聚焦 x2 扫描选项，以将发射信号最佳调整至亚饱和水平。

随后可调整设置以获得各通道的最佳可视效果。显微镜设置优化后，移动载物台以找到一个包含多个显示GCaMP6f荧光自发变化细胞的区域，并将成像平面聚焦至所需位置。使用裁剪矩形工具将成像帧裁剪至可实现略低于1秒帧间隔的尺寸。将时间间隔设为1.0，采集帧数设为600。

要采集时间序列电影，请选择时间选项，然后使用 XYt 扫描模式开始成像。观察成像进度条，并在适当的时间点将灌流液从 HEPES 记录缓冲液切换至 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲液。成像完成后，点击“序列结束”按钮，并保存完成的时间序列电影。继续用谷氨酸灌流额外五分钟，使培养的神经元总共暴露于谷氨酸环境中 10 分钟。

对每张待成像的盖玻片重复此过程。实验结束后可立即观察神经元胞体中的钙信号轨迹。使用椭圆工具在神经元胞体周围绘制所需数量的感兴趣区域（ROI），然后使用序列分析按钮来可视化信号轨迹。在额外暴露于谷氨酸五分钟之后，用精细镊子将盖玻片从浴槽中取出，并将其放回含有记录缓冲液的培养皿中，直至完成全部成像。