短期与长期大鼠海马神经元培养物的体外钙成像

取代表年轻神经元的短期大鼠海马神经元培养物和代表衰老神经元的长期培养物。

衰老的神经元表现出更高密度的L型电压门控钙通道（L-VGCCs），在膜去极化后其开放持续时间更长。

使用可扩散进入细胞的荧光钙离子指示剂孵育，然后洗涤以去除多余的染料。

将培养物置于荧光显微镜下的灌流室中。

引入含有神经递质的溶液，这些神经递质可与神经元上的受体结合，诱导钠离子内流并引发膜去极化。

去极化激活L型电压门控钙通道（L-VGCCs），使钙离子流入细胞质。

在长期培养中，L型电压门控钙通道（L-VGCCs）的密度增高及其开放时间延长，导致钙超载，这是神经元衰老的典型特征。

钙离子与指示剂结合后产生荧光，衰老神经元表现出更高的荧光强度，反映出刺激后细胞内钙离子水平升高。

在此步骤中，将细胞与 Fura2-AM 在室温避光条件下孵育 60 分钟，然后将盖玻片转移至灌流室。随后，将带有盖玻片的灌流室置于倒置显微镜的载物台上。选择显微视野，并用预热的 HBS 持续灌流细胞。

随后，使用340纳米和380纳米的光对细胞进行透射照明，最终通过荧光相机每5至10秒记录一次520纳米处发射的光，该光经过Fura-2二向色镜过滤。为分析所记录的荧光图像，首先打开实验文件。

使用 AquaCosmos 软件，单击“Ratio”并选择所需的比率范围。对所得图像进行逐像素比率计算，以获得一系列比率图像。然后通过调节背景光照按钮来扣除背景。接着，按下“Start Calculation”。随后，按下“All Time Sequence”按钮并清除原有的 ROI。

对于单个细胞的定量分析，需建立新的感兴趣区域（ROI），或选择对应于单个神经元的感兴趣区域。要绘制单个记录的图像，请点击“Graph”按钮，将每个感兴趣区域对应的荧光比率值导出至Origin实验室软件，然后点击“Calculate”并保存为TXT文件。随后，进行相应计算，以估算每次刺激引起的荧光比率上升幅度的大小。