0 次观看 • 3:14 分钟 • May 29th, 2025
从神经退行性小鼠模型的脑切片开始。
使用添加去污剂的封闭液孵育，以增强组织通透性并阻断非特异性结合。弃去封闭液。
加入靶向β-淀粉样蛋白斑块的一抗。在振荡条件下孵育，使一抗与β-淀粉样蛋白斑块结合，随后洗涤。
加入红色荧光标记的二抗，并在避光条件下孵育，以使抗体发生结合反应。
洗涤以去除未结合的抗体，随后进行酒精洗涤。
加入姜黄素（可高亲和力结合富含β-折叠的淀粉样蛋白），然后洗涤。
接着，用浓度递增的酒精处理，以脱水脑切片。加入二甲苯以去除任何残留的试剂。
将切片置于载玻片上，并在荧光显微镜下观察。
使用波长为 590 纳米的激光激发二抗上的红色荧光染料。采集图像。
切换至480纳米波长的激光以激发姜黄素，使其发出绿色荧光。
叠加图像；红色和绿色荧光的共定位证实了脑组织中的β-淀粉样蛋白斑块。
使用抗Aβ抗体对冷冻切片样本进行标记时，先在12孔板的各个孔中用新鲜PBS洗涤样本三次，每次洗涤均更换PBS，随后在室温下用含10%正常山羊血清和0.5% Triton X-100的PBS溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间为1小时。
孵育结束后，弃去封闭液，将样品在4摄氏度、150转/分钟条件下与Aβ特异性抗体孵育过夜。次日早晨，用新鲜的PBS溶液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次，随后在避光条件下室温孵育与红色荧光染料偶联的适当二抗，孵育时间为1小时。
孵育结束后，用 PBS 洗涤切片三次，随后用 70% 乙醇洗涤一次。乙醇洗涤后，在室温下用 10 µM 姜黄素孵育切片 10 分钟，然后用 70% 乙醇洗涤三次，每次 1 分钟。
最后一次洗涤后，依次用90%和100%乙醇脱水，每种浓度各1分钟，然后用新鲜二甲苯浸洗两次，每次浸洗5分钟以透明切片。随后按所示方法封片并成像。