为什么零假设检验对淀粉样蛋白-β斑块成像很重要？

零假设检验使研究团队能够严格评估观察到的斑块标记是否具有统计学显著性，从而支持可靠的目标验证，并减少早期发现中的假阳性结果。

自变量隔离如何融入免疫标记和姜黄素实验流程？

分离抗体特异性和姜黄素浓度等变量，可确保观察到的荧光信号源于淀粉样蛋白-β斑块，从而增强对成像结果机制解释的可信度。

定量因变量测量在斑块成像中能够实现什么？

通过定量测量荧光强度和斑块面积，可对治疗效果进行客观比较，从而支持化合物筛选和临床前研究中的数据驱动决策。

为何在此方案中，重复性要求对于跨职能协作至关重要？

在不同样本和实验之间进行重复，可确保成像结果的可重复性和可靠性，从而实现跨团队的数据整合以及基于整体项目组合的决策。

在实施双标记斑块成像之前，需要具备哪些统计分析能力？

团队必须具备进行共定位分析、信号定量以及成像数据的统计比较的能力，以验证研究结果并支持转化应用的推进。

通过免疫标记与姜黄素染色对脑组织切片中的β-淀粉样蛋白斑块进行成像

JoVE Encyclopedia of Experiments

神经科学

0 次观看 • 3:14 分钟 • May 29th, 2025

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从神经退行性小鼠模型的脑切片开始。

使用添加去污剂的封闭液孵育，以增强组织通透性并阻断非特异性结合。弃去封闭液。

加入靶向β-淀粉样蛋白斑块的一抗。在振荡条件下孵育，使一抗与β-淀粉样蛋白斑块结合，随后洗涤。

加入红色荧光标记的二抗，并在避光条件下孵育，以使抗体发生结合反应。

洗涤以去除未结合的抗体，随后进行酒精洗涤。

加入姜黄素（可高亲和力结合富含β-折叠的淀粉样蛋白），然后洗涤。

接着，用浓度递增的酒精处理，以脱水脑切片。加入二甲苯以去除任何残留的试剂。

将切片置于载玻片上，并在荧光显微镜下观察。

使用波长为 590 纳米的激光激发二抗上的红色荧光染料。采集图像。

切换至480纳米波长的激光以激发姜黄素，使其发出绿色荧光。

叠加图像；红色和绿色荧光的共定位证实了脑组织中的β-淀粉样蛋白斑块。

使用抗Aβ抗体对冷冻切片样本进行标记时，先在12孔板的各个孔中用新鲜PBS洗涤样本三次，每次洗涤均更换PBS，随后在室温下用含10%正常山羊血清和0.5% Triton X-100的PBS溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间为1小时。

孵育结束后，弃去封闭液，将样品在4摄氏度、150转/分钟条件下与Aβ特异性抗体孵育过夜。次日早晨，用新鲜的PBS溶液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次，随后在避光条件下室温孵育与红色荧光染料偶联的适当二抗，孵育时间为1小时。

孵育结束后，用 PBS 洗涤切片三次，随后用 70% 乙醇洗涤一次。乙醇洗涤后，在室温下用 10 µM 姜黄素孵育切片 10 分钟，然后用 70% 乙醇洗涤三次，每次 1 分钟。

最后一次洗涤后，依次用90%和100%乙醇脱水，每种浓度各1分钟，然后用新鲜二甲苯浸洗两次，每次浸洗5分钟以透明切片。随后按所示方法封片并成像。