小鼠脑组织中狂犬病病毒感染的三维可视化

取一份感染狂犬病病毒的小鼠的固定厚脑切片。

病毒侵染神经元并进行复制，导致细胞内存在病毒蛋白。

使用去垢剂处理以通透细胞膜，并用封闭液处理以封闭非特异性结合位点。

先与靶向病毒蛋白的一抗孵育，随后与结合一抗的荧光素标记二抗孵育。

使用荧光核酸结合染料对细胞核进行标记。

使用浓度递增的酒精对组织进行脱水，然后应用透明化溶液以提高组织透明度，便于成像。

将切片置于成像腔室中，加入透明溶液并封片。

使用共聚焦激光扫描显微镜，分别利用荧光标记对组织进行成像，然后将图像合并以生成二维图像。

在组织的不同焦平面上采集图像，并将其合并以生成三维图像，用于评估感染进展。

对脑组织切片进行免疫染色时，先将样品在含有0.2% Triton X-100的4毫升PBS溶液中洗涤两次，每次1小时；随后在37摄氏度下，使用含有0.2% Triton X-100、20%二甲基亚砜和0.3摩尔甘氨酸的4毫升PBS溶液进行通透处理，持续两天。接着在37摄氏度下，用含有0.2% Triton X-100、10%二甲基亚砜和6%正常血清的4毫升PBS溶液封闭非特异性结合位点，持续两天。

封闭孵育结束后，在37摄氏度下用2毫升一抗溶液标记样本5天，于第2.5天更换一次抗体溶液。随后，用4毫升含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS缓冲液洗涤样本1天，期间至少更换洗液4至5次，并将最后一次洗涤液过夜保留。

第二天，在37摄氏度下将样品置于2毫升二抗溶液中孵育5天。随后，如图所示，用4毫升新鲜的含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS缓冲液洗涤样品。

对样品进行细胞核染色时，将样品在4毫升核酸染料TO-PRO-3中孵育5小时，避光操作。孵育结束后，按所示方法用含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS缓冲液洗涤样品，随后用递增浓度的叔丁醇系列溶液进行脱水处理，每次浸泡2小时。

在90%的浸入处理后，将样品转移至96%的叔丁醇溶液中过夜。次日早晨，再用100%叔丁醇对样品脱水2小时，随后在新配制的BABB-D15中透明化2至6小时，直至组织切片在光学上完全透明。之后可将样品保存在BABB-D15中，避光存放，直至进行封片和成像。

用于样本安装时，使用3D打印机打印成像室及盖子。用单组分室温硫化硅橡胶将一个直径30毫米的盖玻片固定到成像室上。同样地，将一个直径22毫米的盖玻片固定到盖子上。在让橡胶过夜固化之前，使用蘸水的棉签清除两个环上多余的硅橡胶。

第二天，将样品放入成像腔室中，在盖上盖子前向腔室内加入少量 BABB-D15。使用皮下注射针通过入口将腔室完全充满 BABB-D15，然后堵住入口，并用硅橡胶密封成像腔室。

设置图像采集时，选择与所用荧光染料相匹配的合适激光线，并调整每个检测器的检测范围，以防止通道间的信号重叠。然后设定采集参数，定义图像层叠的上限和下限边界，并采集图像层叠数据。

为生成图像堆栈的三维投影，在 Fiji 中打开图像文件，选择图像、颜色、通道工具、更多、拆分通道，将合并的图像拆分为各个独立通道。对每个通道的图像进行漂白校正时，选择图像、调整、漂白校正，然后选择简单比率法。使用滑块调节各通道的亮度和对比度，然后选择图像、颜色和合并通道。勾选创建复合图像选项。

将图像转换为 RGB 格式，然后选择图像、堆栈和 3D 投影以生成三维投影。选择“最亮点”作为投影方法，并将切片间距设置为与所获取图像堆栈的 Z 步长一致。为获得最高质量，将旋转角度增量设置为 1，并启用插值。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。然后将 3D 投影同时保存为 .TIFF 和 .AVI 文件格式。