小鼠脑组织中狂犬病病毒感染的三维可视化

从感染狂犬病病毒的小鼠身上取出一个固定的厚脑切片。

该病毒感染神经元并复制，导致细胞内存在病毒蛋白。

用洗涤剂处理以透化细胞膜，并用封闭溶液掩盖非特异性结合位点。

与靶向病毒蛋白的一抗孵育，然后与一抗结合的荧光团偶联二抗孵育。

用荧光核酸结合染料处理以标记细胞核。

增加酒精浓度的情况下使组织脱水，然后应用透明溶液以增加成像的组织透明度。

切片安装在成像室中，用透明溶液填充，然后密封。

使用共聚焦激光扫描显微镜，使用荧光标记单独对组织进行成像，然后将它们合并以创建二维图像。

在整个组织的不同焦平面上获取图像，并将它们组合起来生成用于评估感染进展的三维表示。

对于脑组织切片的免疫染色，在4毫升0.2%Triton X-100的PBS中洗涤样品两次，持续1小时，然后在37摄氏度下透化两天，在4毫升的0.2%Triton X-100,20%二甲基亚砜和0.3摩尔甘氨酸PBS中。在37摄氏度下用4毫升0.2%Triton X-100,10%二甲基亚砜和6%正常血清在PBS中阻断任何非特异性结合两天。

封闭孵育结束时，用2毫升一抗溶液在37摄氏度下标记样品五天，两天半后刷新抗体溶液。接下来，在PBS中的4毫升0.2%吐温20和10微克肝素中洗涤样品一天，在一天中至少交换洗涤缓冲液四到五次，并让最后一次洗涤过夜。

第二天，将样品在2毫升二抗溶液中在37摄氏度下孵育五天。然后，如图所示，在 PBS 中用 4 毫升新鲜的 0.2% 吐温 20 和 10 微克/毫升肝素洗涤样品。

对于样品的核染色，将样品在4毫升核酸染色剂TO-PRO-3中孵育5小时，避光。在孵育结束时，如图所示，在PBS中以0.2%吐温20和10微克/毫升肝素洗涤样品，然后在升序叔丁醇系列中脱水，每次浸泡2小时。

90% 后，将样品转移到 96% 叔丁醇溶液中过夜。第二天早上，将样品在100%叔丁醇中进一步脱水2小时，然后在新鲜制备的BABB-D15中清除组织切片2至6小时，直到它们光学透明。然后可以将样品储存在 BABB-D15 中，在安装和成像之前避光

对于样品安装，请使用 3D 打印机打印成像室和盖子。将直径为 30 毫米的盖玻片安装到成像室上，并采用一种组分室温硫化硅橡胶。同样，将 22 毫米的盖玻片安装到盖子上。使用水润湿棉签去除两个环上多余的硅橡胶，然后让橡胶固化过夜。

第二天，将样品放入成像室中，并在插入盖子之前向室中加入少量 BABB-D15。使用皮下注射针头，通过入口用 BABB-D15 填充腔室并塞住入口，然后用硅橡胶密封成像室。

要设置图像采集，请为所使用的荧光团选择合适的激光线，并调整每个检测器的检测范围，以防止通道之间的信号重叠。然后设置采集参数，定义堆栈的上下边界，采集图像堆栈。

要生成图像堆栈的 3D 投影，请在斐济打开图像文件，然后选择图像、颜色、通道工具、更多和拆分通道，将合并的图像拆分为单独的通道。要对每个通道的图像进行漂白校正，请选择图像、调整、漂白校正，然后选择简单比例。使用滑块调整每个通道的亮度和对比度，然后选择图像、颜色和合并通道。勾选选项 创建复合材料。

图像转换为 RGB 格式，然后选择图像、堆栈和 3D 项目以生成 3D 投影。选择最亮点作为投影方法，并设置切片间距以匹配采集图像堆栈的 Z 步长大小。为了获得最高质量，请将旋转角度增量设置为 1 并启用插值。根据需要修改 总旋转（Total rotation）、 透明度阈值（Transparency thresholds） 和 不透明度（Opacity）。然后将 3D 投影另存为 both .TIFF 和 .AVI 文件格式。