使用光片荧光显微镜可视化运动神经元投影和轴突分支

0 次观看5:40 分钟 • May 29th, 2025

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从在脊髓运动神经元中表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠胚胎中取化学固定和清除的组织片段。

组织垂直安装到改良的移液器吸头上。

将尖端连接到固定在光片荧光显微镜内的毛细管上。

组织下方放置一个充满缓冲液的样品室,使其浸入水中并清除碎屑。

使用成像软件,将组织对齐光路。

开始图像采集。

光源发射一片薄薄的激光,激发组织单个平面上的 GFP 以发出荧光。

垂直于

光路的检测器捕获发射的荧光。

获取脊髓运动神经元的图像以生成轴突分支形态的 3D 重建。

使用软件绘制轴突图,识别分支模式和终点,以评估运动神经元的生长和连接。

设置 5X/0.1 照明光学器件和 5X/0.16 检测光学器件。组装样品架和样品毛细管。通过填充透明溶液来准备样品室。要安装胚胎,请通过切掉上部以使其适合毛细管的直径来准备P200移液器吸头,并移除用于样品连接的尖头部分。

然后,用小火焰熔化移液器吸头的钝端。熄灭火焰并快速将胚胎垂直附着在熔化的末端。将移液器吸头的上部与样品毛细管配合,并将准备好的样品室放入显微镜中。使用成像软件,选择"定位"选项卡下的"定位毛细管",然后调整 xy 轴和 z 轴。

接下来,选择"定位样本"并缩放到 0.6 倍以聚焦于胚胎。让腔室缓冲液与胚胎平衡一段时间,以清除任何碎屑或气泡。对于采集选项卡下的图像采集,定义光路参数,例如检测物镜、激光阻挡滤光片、分束器、相机和激光器。

选中透视扫描复选框以减少阴影。然后,定义采集设置,位深度为 16 位。缩放到 0.36 到 0.7 倍单面照明或双面照明之间的范围。单击连续,设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置。随后,按停止结束图像采集。

重要的是要

确保透明样品位于最短的光路内,以便详细采集单个运动神经上精细直立结构的图像。

对于多维采集,通过移动第一张和最后一张图像的 Z 位置来定义 Z 堆栈。单击"最佳"以设置切片编号。然后,单击"开始实验"以获取选定的 Z 堆栈。完成后,将图像保存为点 CZI 格式。

要量化轴突树枝化,请在成像分析软件中打开图像文件。使用显示调整窗口调整图像颜色、亮度和对比度,以根据局部强度对比度检测灯丝。接下来,单击"添加新灯丝"图标,然后在下拉菜单中选择自动路径算法。选择感兴趣的区域。

然后,通过分配最大和最薄直径的测量值来定义起点和种子点,这些测量值可以使用切片模式进行测量。在感兴趣区域的边缘指定起点。要实现手动添加或删除起点,首先,更改指针模式,导航选择,然后在感兴趣点处移动并单击鼠标右键。

接下来,选择种子点的手动阈值,以确保标记所有可见的乔木化。然后,手动添加或删除种子点。选中"移除断开连接的线段"复选框,然后移除起点周围的种子点。随后,调整 背景减法阈值 并完成该过程。

有必要去除背景伪影并确认检测器路径反映真实的轴突树枝化,以便准确定量。

最后,选择所需的款式和颜色。在"统计"选项卡下,选择"详细",并使用细丝数树突终端点来量化运动神经末梢,作为运动轴突树枝的指标。然后,将重建的轴突的图像导出为 .TIFF 文件。

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最后更新:18 七月 2026