使用光片荧光显微镜观察运动神经元投射及轴突分支

取一段来自转基因小鼠胚胎的经化学固定并透明化处理的组织，该转基因小鼠胚胎的脊髓运动神经元表达绿色荧光蛋白（GFP）。

将组织垂直固定在经过改造的移液器吸头

将尖端连接到固定在光片荧光显微镜内的毛细管上。

将充满缓冲液的样品室置于组织下方，以浸没组织并清除碎片。

使用成像软件，将组织对准光路。

开始图像采集。

光源发射一束薄薄的激光片，激发组织单一层面上的绿色荧光蛋白（GFPs）发出荧光。

位于光路垂直位置的检测器捕获发射的荧光。

获取脊髓运动神经元的图像，以生成轴突分支形态的三维重建。

使用软件绘制轴突图谱，识别分支模式和终点，以评估运动神经元的生长和连接性。

设置5X/0.1照明光学系统和5X/0.16检测光学系统。组装样品支架和样品毛细管。用透明溶液填充样品室以完成样品室的准备。为安装胚胎，准备一个P200移液器吸头，剪去上部使其直径与毛细管匹配，并去除尖端部分以便固定样品。

然后，用小火焰熔化移液枪头的平端。熄灭火焰，迅速将胚胎垂直附着在熔化的末端上。将样品毛细管安装到移液枪头的上部，并将制备好的样品室放入显微镜中。使用成像软件，在“定位”选项卡下选择“定位毛细管”，并调节 xy 轴和 z 轴。

接下来，选择“定位样本”，并将放大倍数调整至0.6倍以聚焦胚胎。让腔室缓冲液与胚胎平衡一段时间，以清除任何碎片或气泡。在“采集”选项卡下进行图像采集时，需设定光路参数，例如检测物镜、激光阻挡滤光片、分光镜、相机和激光器。

选中“枢轴扫描”复选框以减少阴影。然后设置采集参数，位深度为16位。将放大倍数调整至0.36至0.7倍，可选择单侧照明或双侧照明。点击“连续采集”，并设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置。随后，按“停止”以结束图像采集。

必须确保透明样本位于最短的光路中，以便对单个运动神经上的精细直立结构进行详细的图像采集。

进行多维图像采集时，通过移动第一张和最后一张图像的 Z 轴位置来定义 Z 轴层叠范围。单击“最优”以设置切片数量。然后单击“开始实验”以采集选定的 Z 轴层叠图像。采集完成后，将图像保存为 .CZI 格式。

为了量化轴突分支，将图像文件在成像分析软件中打开。使用显示调节窗口调整图像的颜色、亮度和对比度，以基于局部强度对比度来检测纤维结构。接着，点击“添加新纤维”图标，并在下拉菜单中选择自动路径算法。选择感兴趣的区域。

然后，通过分配最大和最小直径的测量值来定义起始点和种子点，这些测量值可使用切片模式进行测量。在感兴趣区域的边缘设置一个起始点。若需手动添加或删除起始点，首先更改指针模式为“Navigate Select”，然后按住 Shift 键并右键单击感兴趣的点。

接下来，选择“为种子点手动设置阈值”，以确保标记出所有可见的分支结构。然后，手动添加或删除种子点。勾选“移除不连通的片段”选项，并删除起始点周围的种子点。随后，调整背景减除的阈值，完成该过程。

必须去除背景伪影，并确认检测路径反映真实的轴突分支，以实现准确的定量分析。

最后，选择所需的样式和颜色。在“统计”选项卡下，选择“详细”，并使用纤维数量的树突末端点来量化运动神经末梢，作为运动轴突分支的指标。然后，将重建的轴突图像导出为 .TIFF 文件。