0 次观看 • 4:38 分钟 • May 29th, 2025
取自小鼠坐骨神经和背根神经节（DRG）中分离的细胞。
使用针对 CD45 和 CD11b 的荧光标记抗体，以及针对 MHC II 类分子的生物素标记抗体孵育，以标记免疫细胞。
使用与生物素结合的荧光染料标记的链霉亲和素进行孵育。
使用固定剂处理以稳定细胞结构。
加入含荧光DNA染料的透化缓冲液，以透化细胞膜并标记细胞核。
使用流式细胞仪，使细胞通过激光束，以评估其光学和荧光特性。
通过去除DNA荧光较高的聚集体来分离单个细胞，并检测标记物的荧光信号。
鉴定表达 CD45（免疫细胞的特征性标志物）的细胞，以确认其存在。
背根神经节中大多数 CD45 阳性细胞表达 CD11b 和 MHC II 类分子，表明为类似小胶质细胞的细胞，而此类细胞在坐骨神经中不存在。
该技术可与成像方法结合，用于分析神经系统组织内免疫细胞的异质性。
在计算机上，选择用于检测目标荧光染料的合适通道、样品的合适流速，以及每个样品需采集的总事件数。最低事件数应为100万。
接下来，在全局工作表中创建侧向散射A对前向散射A的散点图，以及每种目标荧光染料对前向散射A的散点图。同时，创建一个统计视图，以显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度。
根据仅用DAPI染色的对照样本的散点图确定亲本门P1。将样本连接至流式细胞仪并点击“采集”。观察DAPI相对于FSC的散点图，并逐步降低DNA Pacific Blue通道的电压，直至DAPI阳性群体可见。使用矩形门控工具，在DAPI阳性群体周围绘制一个矩形区域，此即为P1门。选择每种荧光染料对应的散点图，并仅显示DAPI阳性事件，这些即代表各荧光染料的背景荧光水平。
使用矩形门控工具，在每种荧光染料的散点图中从 y 轴 103 处开始绘制方框。该门控区域表示所述各标记物阳性事件应出现的范围。利用仅含 DAPI 染色的对照样本调节每种荧光染料的电压。将样本连接至流式细胞仪，然后点击“采集”。
观察每种荧光染料对应的 DAPI 阳性细胞群的位置，并调整相应的电压，使细胞群位于矩形门控区域之外。流式细胞仪设置完成后，运行样品并导出前向散射文件以供进一步分析。