使用共聚焦显微镜对斑马鱼幼虫进行选择性单神经元激光消融

取预热的琼脂糖溶液，其中含有麻醉的转基因斑马鱼幼虫，在脊髓运动神经元中表达荧光蛋白。

幼虫转移到带有琼脂糖环的玻璃盘中。

使用显微镜，将幼虫侧翻。然后，让琼脂糖凝固，使幼虫固定。

添加含有麻醉剂的缓冲液以维持麻醉。

将培养皿放在共聚焦显微镜载物台上，并使用明场成像来定位背脊髓区域。

切换到荧光模式以可视化荧光运动神经元。

确定细胞体的中心 z 平面以进行精确的消融靶向。

配置成像参数以实现高分辨率采集，同时最大限度地减少光损伤。

一旦所需的 z 平面聚焦，使用聚焦紫外激光对目标神经元区域进行消融。

激光能量破坏细胞结构，导致荧光损失和细胞死亡。不可逆的荧光损失在不影响周围细胞的情况下确认了精确的消融。

使用可调节移液器吸出幼虫，让它沉入吸头底部。将幼虫放入最小体积的液体中放入预热的琼脂糖中，然后用琼脂糖吸取鱼，并快速将其分配到预先准备好的 35 毫米玻璃底培养皿中。在解剖显微镜下，使用标准画笔将动物或多只动物侧面放置在琼脂糖内，使身体和尾巴平坦。

让嵌入的鱼静置 10 至 15 分钟，直到琼脂糖牢固凝固。然后，使用大约两毫升的鸡蛋水和 trikane 小心地加满 35 毫米培养皿。将嵌入幼虫的培养皿放在共聚焦显微镜载物台上，并使用明场照明和40倍放大倍率，聚焦在动物脊髓的背侧。切换到适当的荧光设置，并可视化感兴趣的结构，以确认所有成像参数都符合后续消融的需要。

要确定紫外激光烧蚀结构的厚度，请使用 Z 驱动器通过手动上下聚焦来验证感兴趣结构的顶部和底部。手动记录将要烧蚀的 Z 平面，例如，细胞的中心。要进行激光烧蚀，请通过单击软件菜单顶部的下拉菜单启动 FRAP 向导。

在新窗口中，通过选择格式、扫描速度和平均来确定消融方法的图像参数。如果尚未选择用于消融的 Z 平面，请按下实时按钮并聚焦在样品中，直到荧光结构或要消融的所需 Z 平面对焦。设置一般图像参数后，访问漂白步骤以控制特定的消融组件，然后通过激活 405 纳米激光器进行漂白程序。

接下来，使用放大选项通过减少扫描场来最大化所选 ROI 的漂白强度，从而最大限度地延长停留时间。使用图像采集窗口中的任何绘图工具为烧蚀选择一个或多个 ROI。例如，使用大约 4 至 8 微米的圆形绘图工具瞄准轴突小丘。

建立 ROI 后，选择时程按钮并确认将扫描和消融 ROI 的周期数。根据需要选择漂白前和漂白后框架，以便在漂白过程之前和之后立即概览整个图像。

这些设置允许研究人员进行多层细化。通过调整激光功率、扫描速度、线平均、感兴趣区域的大小和重复次数，该技术提供了高度的自由度，可以导致单个细胞的压力或死亡。

建立所有必要的消融参数后，按运行实验并监控消融效率。有关其他详细信息，请参阅文本协议。