表皮内神经纤维中线粒体的可视化

从含有表皮内神经纤维（IENFs）或细小感觉神经元末梢的表皮皮肤组织切片开始。

表皮内神经纤维富含线粒体，为神经元信号传递提供能量。

该组织的IENF、线粒体和表皮细胞核均带有荧光标记。

使用倒置共聚焦显微镜，依次在适合的波长下采集细胞核、表皮内神经纤维和线粒体的离散荧光信号。

启动活体扫描以捕获IENF信号，包括表皮层。

然后，对每个信号进行顺序扫描，以消除荧光信号串扰。

使用软件，从合并的图像中裁剪并分离发出蓝色荧光的表皮细胞。

然后，对裁剪区域进行处理，以增强绿色IENF信号和红色线粒体信号的分辨率。

接下来，生成三维表面图像以创建IENF的掩膜，然后将其叠加到线粒体表面图像上，以分离神经特异性线粒体。

在最终的输出图像中，IENF呈青色，而线粒体则呈现为微小的品红色结构。

在倒置激光扫描共聚焦显微镜上选择 40 倍油浸物镜。选择适当的激光器和探测器以成像细胞核、神经纤维和线粒体。在显微镜软件中输入以下扫描参数：12 位强度分辨率，扫描速率为 600 Hz，采用双帧平均，放大倍数为 2.2。通过选择 1024 × 1024 的扫描分辨率，在显微镜软件中优化横向分辨率。通过选择 1 个艾里单位的共聚焦孔径和 210 纳米的 z 轴步长，优化轴向分辨率和光学切片效果。

分别扫描每个信号，并调整检测器电压和偏移，以消除任何过饱和和欠饱和的像素。激活神经信号的实时扫描，调节显微镜软件中的z轴焦距控制，找到并设定包含组织切片内神经信号的上下焦平面。使用顺序扫描方式扫描最终的z序列，以消除荧光信号间的串扰。

使用选择工具在原始图像的复制图像上围绕表皮绘制区域，从而将表皮从角质层和真皮中分离出来，然后将图像裁剪至所选区域。利用“计算扩展函数”功能，计算绿色和红色荧光共聚焦信号的点扩散函数。随后设置介质折射率参数：油镜为1.515，40倍油镜物镜的数值孔径为1.25。将探测器针孔设为一个单位面积，并选择激光激发波长。

使用迭代恢复，设置置信度为100%，迭代次数上限为10个循环，并分别采用绿色和红色的点扩散函数（PSF）对绿色和红色荧光信号进行去卷积。使用“创建表面”（Create surface）工具在去卷积后的神经信号周围生成表面，选择未勾选平滑特征、以绝对强度进行阈值分割，下限阈值设为3,000，上限阈值设为65,535。保留体积大于10个体素的表面。

使用神经表面的“编辑”选项卡选择单个非神经表面，或按住 Control 键选择多个非神经表面，以去除非神经表面。按下 Delete 按钮删除所选的非神经表面。在神经表面使用“编辑”选项卡，然后在“掩膜属性”中按下“全部掩膜”按钮。

在新窗口中，于通道选择下选择通道5线粒体去卷积，然后在应用掩膜前勾选复制通道。按下内外常数的单选按钮，并勾选将表面外部体素设置为0.0。然后按确定按钮。

最后，使用“创建表面”工具生成线粒体特异性表面，选择未勾选的“平滑特征”选项，并采用背景减除法进行阈值设定，以围绕经掩膜处理的去卷积线粒体信号生成表面。将最大球体直径设置为1.50微米，下阈值设为2,000，上阈值设为最大值65,535。确保生成的表面体积大于1.0体素。