使用连续块面扫描电子显微镜对神经元线粒体进行成像

取含有海马体的修整后树脂包埋小鼠脑组织切片。

使用重金属对切片进行染色，以增强在电子显微镜下的对比度。

使用氰基丙烯酸酯胶水将切片固定在铝制样品钉上。

使用导电银胶涂覆样品块的侧面，以在样品与铝制针脚之间建立导电通路。

使用连续块面扫描电子显微镜（SBFSEM）检查组织块。

在SBFSEM中，超薄切片机将样品块连续切割成超薄切片，同时低电压电子束扫描暴露的表面。

背散射电子探测器可捕获高分辨率的二维图像，揭示线粒体及其周围的细胞结构。

使用适当的软件调整亮度和对比度，以提高图像清晰度。

对连续图像进行对齐，以重建脑组织的三维体积。该三维重建可实现对线粒体形态、空间分布及其在神经元区室内部关系的精确映射。

将样品修剪至目标区域，并使用凝胶型氰基丙烯酸酯超级胶水将其固定在铝制样品钉上。然后在样品块侧面涂覆胶态银浆，以提供通往铝制样品钉的导电通路。使用配备腔内超薄切片机载台和低千伏背散射电子探测器的扫描电子显微镜系统对组织样本进行观察。

使用这些设置对样品进行成像。开始分析时，首先选择图像类型，然后选择8位，将图像从原始的专有16位格式转换为8位TIFF格式。如果在此步骤中自动的对比度和/或亮度转换对图像效果不理想，请重新打开16位图像，点击图像，调整亮度和对比度。

选择一个适用于所有图像的范围，然后点击应用。接着执行转换。如果切片间存在不可接受的图像移动，请通过选择“插件”、“配准”和“使用SIFT进行线性堆栈配准”，并将配准模式设置为仅平移模式（而非刚体模式），对图像堆栈进行对齐。

在进行配准之前，通过选择图像调整画布大小来扩大画布尺寸。或者，通过选择目标区域并进行裁剪，将图像缩小至感兴趣的区域。如有需要，可使用 ImageJ 选择图像并进行缩放，将图像调整为更小、更易于处理的尺寸。