髓鞘化小鼠轴突中神经丝运输的荧光光激活成像

从放置在倒置显微镜载物台上的灌流装置开始。

灌流装置包含一段已解剖的周围神经，该神经被固定在盖玻片与微通道载玻片之间，并持续灌注生理盐水。

该神经的髓鞘化轴突表达绿色荧光团标记的神经丝蛋白。

使用明场照明，聚焦于有髓鞘的轴突。

切换至共聚焦模式，使用高激光功率进行光漂白，然后使用低激光功率采集低自发荧光的参考图像。

沿轴突绘制平行线以确定光激活窗口的长度，以此为参考创建矩形激活区域。

用特定波长照射该区域，以激活绿色荧光标记的神经丝蛋白，使其产生荧光。采集图像。

激活后，采集时间序列图像。

随着时间的推移，荧光标记的神经丝向两个方向移动，并扩散到相邻的侧翼区域。

激活区域两侧邻近区域出现荧光，证实了神经丝的运输。

抓住神经的近端，缓慢将其放置在盖玻片上，然后在轻微张力下将其拉直。将微流道载玻片有凹槽的一面朝下覆盖在神经上，并使流动方向与神经平行。将盖玻片和微流道组件翻转过来，放入灌流室外壳中，使载玻片与外部垫圈相对。

为固定灌流室，将其放入金属外壳中并旋转锁定环。缓慢下压生理盐水注射器的推杆，填充灌流室。在安装和成像过程中，始终确保进液管和出液管、出液瓶以及注射器的位置高于灌流室本身。将灌流装置转移至倒置显微镜载物台上，并将生理盐水注射器安装到注射泵中。然后启动电机，调节流速至0.25毫升每分钟。

连接管路加热器并将其设定为 37 摄氏度。连接物镜加热器并将其设定为 37 摄氏度。在物镜上滴加镜油，然后将灌流 chamber 插入载物台固定装置中。在 chamber 加热片上滴加镜油，并将其连接至灌流 chamber。随后，连接电源并将其设定为 37 摄氏度。

将灌流室锁定在载物台适配器上，并使物镜油与腔室底部的盖玻片接触。使用明场照明聚焦于神经底面靠近盖玻片表面的轴突层。在未增强对比度的明场透射光照明下，可通过观察到髓鞘的存在来识别有髓轴突。

获取明场参考图像，记录神经的方向性。然后使用488纳米激光器和适用于光激活型GFP的发射滤光片获取共聚焦图像。将激光功率设置为正常成像功率的约五倍，并以3至4分钟的曝光时间采集图像。随后再获取另一幅共聚焦图像，以记录漂白步骤后的预激活自发荧光。

在明场图像中，沿轴突方向绘制一条长度等于所需激活窗口大小的直线。以此直线为参考，垂直于轴突方向在视野范围内绘制一个矩形兴趣区域。使用405纳米激光通过模式激发在此区域内激活GFP荧光，并确保在激活前和激活后立即各采集一幅图像。激活完成后，启动一分钟计时器。计时结束时，开始采集时间序列图像。