双光子显微镜用于成像小鼠幼崽的神经元形态

首先为双光子显微镜设置激发光。

取一只已麻醉的转基因幼鼠，其颅骨上植入了圆形玻璃成像窗和头固定板。

神经元表达红色荧光蛋白，以方便成像。

清洁玻璃成像窗口，并将幼鼠固定在双光子成像台上。

通过调整幼鼠头部，使成像窗口与显微镜物镜对齐。

使用加热垫以维持幼鼠的体温。

调整麻醉气体流速。

在盖玻片上滴加一滴水，然后降低显微镜的物镜。

双光子显微镜利用两个光子激发荧光蛋白，能够在背景噪声和光漂白最小的情况下实现神经元的精细成像。

在不同深度捕获神经元的图像，以观察其结构

最后，将图像堆叠以生成神经元的三维图像，包括其神经突起，用于研究与生长相关的形态学变化。

开始成像时，首先设置双光子激光器的波长。对于RFP激发，使用1,000纳米的波长。用70%乙醇擦拭盖玻片表面。将麻醉后的小鼠幼崽通过钛金属条固定在成像平台的钛金属板上。使用测角仪平台调整头部位置，使盖玻片与物镜平行。

成像过程中使用设定为 37 摄氏度的加热垫维持幼鼠体温，并将异氟烷浓度降低至 0.7% 至 1%。将成像支架置于双光子显微镜的 20 倍物镜下方。在盖玻片上滴加一滴水。

将软件设置为以 1.4 微米的间隔采集 z 轴层叠图像。对于第四层神经元成像，将 z 轴扫描宽度设置在 150 至 300 微米之间，以完整成像整个树突形态。采用慢速扫描和平均成像方法，以获得清晰显示神经元形态的图像。

通常需要超过 20 分钟才能获取完整的树突形态。