用于研究钙瞬变的生物发光成像 果蝇 脑结构

在荧光显微镜载物台上的记录室中，固定一只头部暴露的转基因 Drosophila。

果蝇的蘑菇体包含表达钙敏感型生物发光融合蛋白的神经元，该蛋白可被预加载的辅因子激活。

将灌流管连接到记录室。定位荧光标记的蘑菇体，重点观察萼区和内侧叶。用缓冲液确认灌流通畅。

设定成像参数，并对准蕈形体的萼部和内侧叶。在黑暗环境中，于施加刺激物之前采集蘑菇体的基线荧光图像。

在含钙缓冲液中灌注尼古丁，以激活烟碱型乙酰胆碱受体，引发钙离子内流及生物发光信号的释放。

用缓冲液洗涤以恢复基础条件。

灌注氯化钾以去极化神经元，触发细胞内钙离子释放及生物发光信号的产生。

用缓冲液洗涤以恢复基础条件。

分析图像以评估腹侧和内侧叶中钙离子的空间和时间动态活动。

— 接下来，将样品放置在显微镜载物台上的载玻片上，调节放大倍数至5倍。然后，通过穿刺孔将灌注管插入通道中。将显微镜切换至荧光模式，居中并调节焦距使蘑菇体清晰可见。当蘑菇体清晰聚焦后，将放大倍数调整为20倍。重新居中图像并调节焦距。

接下来，将引流装置置于引流池上方，并调节引流管的高度，使管尖恰好位于引流池上方。然后用林格氏液冲洗样品30秒，以检查引流是否充分。最后，拉下遮光罩，将装置与外界光线完全隔绝。

使用光子成像仪程序中的自动系统，精细调节焦距，并拍摄蘑菇体的参考荧光图像。通过按住 Control 键并单击和拖动感兴趣区域框，将其分别调整至覆盖萼区、细胞体和内侧叶的位置。

现在，记录约5到10分钟的基础值。接着，打开开关以开始尼古丁的流动。同时，按下回车键，并添加一条注释以标明尼古丁流动已开始。一分钟后，停止流动，并在日志中再添加一条注释，标明流动已停止。然后，用任氏液冲洗样品5分钟。

在样品恢复期间，关闭清洗，将计时器设定为额外五分钟，并准备开始氯化钾的灌流。准备开始时，启动氯化钾的流动，并在样品记录中输入“100 毫摩尔氯化钾开始”。一分钟后，停止灌流，并在样品记录中输入“氯化钾关闭”。随后，用任氏液清洗样品一分钟，并将显微镜切换至荧光模式。采集最后一张荧光图像，然后关闭任氏液，取出样品。