双光子显微成像技术用于小鼠脑微血管的活体成像

从一只已麻醉的小鼠开始，其颅骨表面已通过外科手术制备出薄颅窗，并固定有头固定板。

将小鼠仰卧位固定。去除大腿内侧皮肤以暴露股静脉。

将荧光染料偶联物注入静脉，以标记血浆，从而实现血管的可视化。

缝合切口。

将小鼠翻转，并将其头板固定在束缚装置中以稳定小鼠。

将装置转移至双光子显微镜载物台。

在皮层窗上添加生理盐水。降低物镜，直至其接触生理盐水。

使用明场照明，定位成像区域。

切换至双光子成像。

显微镜的激光将低能量的近红外光聚焦到大脑中。

在激光的焦点处，两个光子结合其能量激发染料，使血管发出荧光。

识别毛细血管床——连接动脉与静脉的小血管网络——并将其放大。

获取图像以分析大脑的微血管系统。

在此操作中，去除小鼠左侧大腿内侧的皮肤。接着，定位股静脉。使用1毫升注射器和30号针头，吸取130微升荧光染料溶液。将100微升染料缓慢注入股静脉中。

拔出针头后，对注射部位施加稳定而轻柔的压力，以止住任何出血，并让染料循环5分钟。随后，用缝线闭合手术切口。小心地将小鼠翻转至俯卧位，并将其放入小鼠头部固定板装置中。进行活体双光子成像时，将手术装置转移至双光子显微镜，并确保维持动物的麻醉水平。

接下来，向头板储液槽中加入少量0.9%生理盐水，并降低显微镜物镜，使其与生理盐水接触。然后，使用明场观察物镜定位目标区域。随后，开始双光子成像。在视野屏幕上找到毛细血管床区域，并使用2倍光学变焦放大该区域。利用双光子成像软件采集毛细血管的图像。