多聚谷氨酰胺蛋白聚集的荧光寿命成像在 秀丽隐杆线虫 神经元

从麻醉处理的、年龄匹配的对照组和分子伴侣缺陷型Caenorhabditis elegans线虫开始。

两组均在其神经元中表达易于错误折叠的荧光标记多聚谷氨酰胺蛋白。

在对照组线虫中，分子伴侣蛋白可限制错误折叠的 polyQ 蛋白聚集；而在分子伴侣蛋白缺乏的线虫中，错误折叠的 polyQ 蛋白则易于形成聚集体。

将对照载玻片放置在共聚焦显微镜载物台上，用于荧光寿命成像显微术（FLIM）。

使用脉冲激光照射线虫。

激光激发荧光团，荧光团在返回基态时发射出一个光子。

FLIM 测量荧光寿命——即荧光分子保持在激发态的时间。

在分子伴侣缺陷的线虫中，polyQ 聚集使荧光团发生簇集，促进相邻荧光团之间的能量转移而非光子发射，从而降低荧光寿命。

FLIM 软件对这些寿命进行处理，生成颜色编码图，从而实现对聚集现象的可视化。

与对照组相比，分子伴侣缺陷型线虫的荧光寿命降低，表明多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集增加。

确保线虫完全不动。打开荧光寿命成像采集软件，找到 Tab 按钮并点击启用输出。将载有固定好的 C. elegans 的载玻片置于载物台上，使用10倍放大倍率的物镜在透射光模式下定位线虫在载玻片上的位置。取出载玻片，将物镜切换至63倍放大倍率，并加入所需的浸油介质。

将载玻片放置于载物台上，并定位线虫。开始扫描样品。选择一个感兴趣区域，并聚焦于其最大投影平面。在 FLIM 软件界面上预览所检测到的光子数量。ADC 值应介于 1 × 10⁴ 至 1 × 10⁵ 之间。如有必要，可切换至不同焦平面或提高激光功率以收集更多光子。

- 确保避免光子堆积，但需收集足够数量的光子，以获得良好的荧光寿命拟合与测量结果。

在菜单栏中，选择用于设置采集参数的选项卡。选择扫描同步输入（Scan Sync In）以实现单光子检测。将采集设置为固定时间或固定光子数。点击开始（Start）以启动采集。打开软件，通过“文件（File）”→“加载 FLIM 数据（Load FLIM Data）”导入 FLIM 数据文件。加载同一条件下所有样本的数据，即使这些数据来自不同的实验批次或不同的生物学重复。

如有需要，可通过“分割”、“分割管理器”对单个线虫进行分割，以获得多张 FLIM 图像。拖动裁剪工具围绕目标区域，直至其被高亮显示。完成后，点击“确定”。选择 C. elegans 强度图像中的一个小区域，该区域的衰减曲线将显示在界面右侧的大衰减窗口中。

在“数据”选项卡中进行寿命外推时，设置一个介于 40 至 300 之间的任意积分最小值，以排除过暗而无法获得良好拟合的像素。选择时间最小值和时间最大值，将荧光寿命成像信号限制在这些数值范围内。请勿更改预设的光子计数（设为 1）。输入采集过程中所用激光器的重复频率（单位为兆赫兹）。

输入一个门控最大值，以排除所有饱和像素。在“寿命”选项卡中，选择要使用的全局拟合方式。除非已知所选的荧光衰减为多指数衰减且具有多个寿命，否则请勿更改除指数数量选择以外的任何其他参数。

通过 IRF 菜单上传 IRF。为估计 IRF 偏移，选择 IRF、Estimate、IRF Shift。一组数值将自动显示在 IRF 选项卡上。一旦确定，不要再更改该选项卡上的任何其他参数。所有参数设置完成后，点击 Fit Data Set。结果拟合以蓝色线条突出显示，应与所有事件重叠。当所有事件均沿拟合线对齐时，即获得良好拟合。

单击软件界面右上方菜单中的“参数”选项卡，选择“统计”和“加权平均值”，并确保卡方值尽可能接近于1。所选图像的寿命值将显示为tau 1。通过“文件”→“导出强度图像”→“拟合结果表格”→“图像”→“直方图”导出任何感兴趣的信息。