活细胞成像观察斑马鱼视网膜再生过程中穆勒胶质细胞核的迁移

从一只转基因斑马鱼中取出琼脂糖包埋的背侧视网膜外植体，置于含培养基的荧光培养皿中开始实验。

视网膜表现出光诱导的感光细胞损伤，并含有表达GFP的Muller胶质细胞或MGCs。

将培养皿放入多光子显微镜的样品室中。

使用明场照明，聚焦于视网膜。

切换至荧光模式以定位MGCs。

从节细胞层（GCL）到外核层（ONL）配置一个z轴堆栈。

开始活体成像。

受损的光感受器释放TNF-α，从而激活MGCs。

MGC 细胞核在内核层（INL）内向基底迁移以复制其 DNA。

随后，细胞核向近端迁移至外核层（ONL），进行有丝分裂，产生神经祖细胞。

有丝分裂后，MGC 细胞核及前体细胞向基底方向迁移，返回至内核层（INL）。

这些前体细胞增殖后迁移到损伤部位，并分化为光感受器，从而实现视网膜再生。

分析捕获的图像以观察细胞核迁移。

在图像采集软件中，打开 A1 MP GUI、TiPad、A1 Compact GUI 和 ND Acquisition 窗口。进行双光子成像时，需在 A1 Compact GUI 窗口中选择 IR NDD 选项。然后，在设置区域中，为第一块二向色镜选择 IR-DM，并确认带通滤光片设置为 525 到 50，以采集 GFP 荧光信号。

接下来，在 A1 MP GUI 窗口中打开红外激光器。激光器需要几分钟时间才能准备就绪。随后，将波长设置为 910 纳米以激发 GFP 荧光，并通过单击自动对准按钮来校准激光器。

将视网膜培养物放置在多光子显微镜载物台上后，务必在打开快门之前关闭房间和设备的照明，以避免光电倍增管过度曝光。为降低噪声水平，应将显微镜置于黑暗环境中。

在扫描区域窗口中设置300 × 300像素的视野范围和2倍放大倍数，在A1 Compact GUI窗口中选择每像素4.8微秒的像素驻留时间，采集图像。通过调整A1 MP GUI窗口中的采集区域和A1 Compact GUI窗口中的增益，大致设置激光功率。

现在，将焦点集中在节细胞层，并在 ND 采集窗口的 Z 子窗口中设置 z-堆栈的顶部焦平面。移动焦平面，穿过外核层水平，该层的特征是存在微弱标记的 GFAP 和 GFP 阳性细胞，这些细胞相较于内核层中的对应细胞呈圆形且体积增大。

将此平面设为z轴堆栈的底部。接下来，将z轴步进大小设置在0.7至1微米之间。为设置z轴强度校正，请打开Z轴强度校正窗口，并选择“From ND”以设定z轴堆栈范围。然后，在Z轴强度校正窗口中点击底部焦平面，并设置激光强度和增益。

随后，单击 Z 强度校正窗口中 z 值旁边的箭头，以确认所选焦平面在 Z 强度校正窗口的设备设置下随后显示的参数设置。对中间和顶部焦平面重复此过程，逐步增加激光功率和增益。

在 A1 MP 图形用户界面窗口中设置采集区域，开始成像时避免选择大于 15 的采集区域和高于 126 的增益，以防止光漂白和噪声水平升高。随后，在 Z 强度校正窗口中选择相对强度校正。在 ND 采集窗口的时间序列子窗口中，将持续时间设置为八小时，时间间隔设置为无延迟。然后，点击 ND 采集窗口中 Z-层扫描子窗口的“运行 Z 校正”以获取三维时间序列图像。