小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

取一个含贴壁神经干细胞或多能神经前体细胞（NSCs）的多孔板，这些细胞分离自转基因小鼠脑组织。这些NSCs含有一种荧光标记蛋白，该蛋白特异性存在于细胞周期的第一个生长期（G1期）。

当NSC分裂时，它在细胞周期的G1期发出荧光，而在其他时期不发出荧光。

将培养皿置于共聚焦激光扫描显微镜的成像室中，并保持在受控温度下。

选择所需的物镜并调节荧光强度。

设置延时成像的参数。

选择大图像选项，并按所需时长定期安排图像采集。

使用高速共振扫描仪以避免光漂白并保持高分辨率。

使用明场设置观察细胞形态，并使用适当的荧光滤光片捕获荧光信号。

开始对神经干细胞进行延时成像，以观察不同的细胞周期时相。

通过将连接的温控室在5%二氧化碳气氛下预热至37摄氏度，准备共聚焦激光扫描显微镜进行成像。将96孔板放入预热的显微镜腔室中，并使第一个孔处于焦点位置。然后，打开成像软件，在主窗口中右键单击以选择“采集采集控制和去采集”，从而打开TI Pad并选择Plan Apo VC 20x DIC物镜。

接下来，单击“采集控制”中的“采集”，然后打开时间序列选项。将每个孔的中心设置为载物台位置，并选择“大图像”选项，设定为 7 乘 7 毫米平方。观察每个孔中心周围的拼接图像。将大拼接图像的重叠率设为 5%，并设置采集频率，使图像每 20 分钟拍摄一次，持续 24 小时。

在 A1 plus 设置下，从菜单栏中列出的每种荧光选择光电倍增管电压水平。选择使用高速共振扫描仪以 512 × 512 像素的格式采集图像，并使用微分干涉差（DIC）观察细胞。然后，选择用于保存数据文件的文件夹。在 ND 采集窗口中单击“立即运行”按钮以开始采集。