Name: 通过飞沫标题细胞封装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学习使用电磁阀喷射系统进行细胞封装的三维生物打印技术，通过优化培养基与水凝胶配方提升细胞存活率。本方法为组织工程与再生医学研究提供可靠的细胞结构构建方案。

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NIH3T3 细胞的制备：
A. 用于喷射的细胞
<ol>
<li>用胰蛋白酶消化细胞，然后以1:1比例加入细胞培养基稀释，并从T75培养瓶转移至15 mL Falcon离心管中</li>
<li>通过离心将细胞沉淀，吸除上清液，并用DPBS洗涤细胞</li>
<li>再次离心使细胞形成沉淀，吸除上清液</li>
<li>将细胞重悬于培养基中</li>
<li>使用血细胞计数板测定细胞密度（约每T75培养瓶200 × 104 个细胞/mL）</li>
<li>离心细胞悬液，吸除上清液，再根据所需的不同细胞浓度，用适量培养基重悬</li>
</ol>
B. 细胞喷射
<ol>
<li>使用前涡旋混匀细胞</li>
<li>将 200 µL 细胞溶液转移至注射器中</li>
<li>设置脉冲发生器的适当模式<ol>
<li>若需喷射单个液滴或多个液滴（脉冲模式），将脉冲发生器设为“E. BUR”模式</li>
<li>若需连续液滴喷射，将脉冲发生器设为“NORM”模式</li>
</ol></li>
<li>调整信号参数<ol>
<li>设置高电平和低电平输出电压：HIL 设为 5 V，LOL 设为 0 V，并确保“LIM”LED 灯亮起</li>
<li>将信号设为方波脉冲</li>
<li>通过调整“WID”值或占空比（“DUTY”）来改变电磁阀开启时间，从而控制液滴喷射时长</li>
<li>通过调整“PER”值来改变喷射频率</li>
<li>通过调整“BUR”值来改变单次脉冲中喷射的液滴数量</li>
</ol></li>
<li>将细胞溶液喷射到已准备好的基底上，用于显微镜成像</li>
</ol>
C. 染色
<ol>
<li>用0.5 µL钙黄绿素-AM和2 µL碘化乙啶同型二聚体溶于1 mL DPBS中配制染色液</li>
<li>将制备好的基质浸入染色液中</li>
<li>在成像前于37°C孵育10分钟</li>
</ol>
实验验证
<ol>
<li>在尼康Eclipse TE-2000 U荧光显微镜上<ol>
<li>Spot高级软件（Diagnostics, Inc.）</li>
<li>活/死细胞检测</li>
</ol></li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

<table><tbody><tr><td>荧光显微镜</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀细胞弹射装置</td><td></td><td></td><td></td><td>工作频率：1 KHz，30 psi，50 nl～0.5 μl；12 V 阀门驱动器：2.5 A 驱动电流</td></tr><tr><td>5加仑便携式气罐</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>压缩空气：30 PSI</td></tr><tr><td>压力调节器</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>驱动频率生成：50 MHz</td></tr><tr><td>XYZ位移台</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>配备步进电机：6英寸行程XY位移台（NLS4-6-25），2.5英寸行程Z位移台（NLS4-2.5-25），三轴控制器（NSC-G3），分辨率为0.1 μm</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>细胞系</td><td></td><td></td><td>成纤维细胞</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td></td><td></td><td></td><td>0.05% 溶液</td></tr><tr><td>NIH 3T3细胞培养基</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>组织培养瓶</td></tr><tr><td>塑料锥形管</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml，用于组织培养</td></tr></tbody></table>

液滴包封细胞

Title Cell Encapsulation by Droplets

我的名字是Hang Moon。我正在与安全套教授合作。他和我一起使用XYJ平台来构建细胞的三维结构。您好，我是PE和Lynn，我们正在开展一项涉及细胞包封以及培养基和凝胶的细胞打印项目。这是用于将细胞及细胞混合物从细胞培养基中喷射出来的电磁阀。该电磁阀由两条信号线控制启动。信号线来自此处的一块干板。信号从这里引出。该线路通过那条线，那条线连接的是函数发生器。首先，这是通过我们预设的程序方式生成的。因此，如果您需要更改流程，可以通过修改程序中的开关线路来实现，或者通过计算机控制该过程生成器。细胞阀通过电信号进行开启和关闭，而细胞则通过该管路供给。细胞以及培养基或农杆菌凝胶通过注射器供给。注射器内部的水中的注射器，其内部通过空气施加压力。加压空气由储气罐通过管线供给，如图中所示。因此，细小的气流和电离空气会穿过空气过滤器。空气过滤器可分离灰尘及其他类型的污物。我们称之为压力发生器，它产生用于开启或关闭太阳能风门的信号，计算机通过 P-I-B-U-S-V 连接器与之相连。因此，我们可以直接通过台式计算机或笔记本计算机的USB端口进行连接，将该设备连接到此处的这一侧。然后，我们可以通过此处的控制用笔记本计算机进行操控。因此，如果我们希望同步舞台的运动与钟罩的开启，可以通过同一台笔记本电脑上的控制器进行控制。这样我们就能控制钟罩开启和关闭的时机，以及舞台移动和停止的时机。同时，我们还能实现运动与钟罩开启的同步。该载物台为电动载物台，通过死亡信号线和电机自动移动。其电机移动精度为0.1微米。因此，理想情况下，它可以绘制长达100毫米的标线。喷射轴以此方式上下移动。这样可控制基板与太阳能带之间的间隙。因此可以控制喷射高度。该基底连接到此处的XY轴平台，X轴在此处，Y轴在彼处。因此，它可在XY平面内移动。因此，它会绘制出某些特征的演示，其中三个轴分别为 X、Y 和 G 轴。喷射控制中的喷嘴轴或 XY 轴由此处的信号进行控制。信号线连接至运动控制器。该运动控制器完全没有手动开关，因为它无法通过手动方式进行控制。通过笔记本电脑进行控制。笔记本电脑已连接。在控制器的背面，我们为打印细胞的 XY 喷头配备了三个 xs。因此，它能独立产生三种不同类型的信号。然后，运动控制器通过射频2、3、2接口直接与无人水面艇（USV）通信，而无人水面艇（USV）再连接到笔记本电脑。因此，由笔记本电脑控制的设备。我们使用 AutoCAD 程序，生成一条类似这样的路径，然后将其转换为机器语言。因此，将机器语言转换为简单的字符和数字等形式。此处每个位置均与X、Y、Z轴平台相关联。我选择包含此类程序的文件，然后以这种方式打开下载程序。接着，我从文件中选择完全相同的文本文件。仅下载文本文件，选择文本文件后，会自动从笔记本电脑下载到Com运动控制器执行程序，然后如我之前提到的，生成BAM字符，BAM。此烧瓶中含有NIH/3T3小鼠成纤维细胞。接下来，我将首先吸除旧的培养基。该操作用于传代细胞，细胞已贴附于培养瓶底部。因此，在吸出培养基后，我将加入六毫升 RYS（一种酶）。好的？加入胰蛋白酶后，需要等待三到五分钟，使细胞从培养瓶底部脱离。现在我们准备加入培养基，并将细胞转移至离心管中。这是一个1:1的稀释过程。因此我在这里加入6毫升培养基，并将培养皿稍微冲洗一下，以确保所有细胞都被转移。现在细胞已准备好在此管中进行离心。接下来，我们将以每分钟1000转的速度离心这些细胞3到5分钟。细胞已离心形成沉淀后，我将吸除上清液。现在我将用PBS清洗细胞。这是为了对细胞进行染色。我们所使用的染料是酯酶底物。好的，现在我们将再次进行离心，使细胞沉淀至管底。接下来，我将吸除PBS，并用培养基重悬细胞，以便进行细胞计数。我正在混匀细胞，以便在取样时，细胞浓度在整个离心管中保持均匀。接下来，我将取100 µL细胞悬液来测定细胞密度。现在加入100 µL台盼蓝染液，这是一种染色剂。我们将等待三到五分钟，以便染料渗透死细胞的细胞膜。计数时，蓝色的细胞不计入。细胞已准备好用血细胞计数板进行计数，我将把50 µL细胞混合液转移至血细胞计数板的两侧。好的，我将用血细胞计数板的一侧盖上盖玻片。血细胞计数板有两侧，我将先计数第一侧，待两侧都计数完毕后，取其平均值，再乘以2，因为样品与蓝色染料进行了1:1的稀释。因此，我们的细胞密度为每毫升135乘以10的4次方个细胞。在本实验中，我们将使用浓度为每毫升50万个细胞的细胞悬液。由于我们共有1350万个细胞，因此我将用27 mL培养基重悬细胞。我们正在使用两种不同类型的染料。这是一种来自 Molecular Probes 的活死细胞检测法。我们的第一种染料称为钙黄绿素 AM。我们的第二种染料称为 AUM 同源二聚体，用于标记死细胞。我们使用蓝色激发光获得绿色荧光，使用绿色激发光获得红色荧光。对于这两种染料，在成像时，我们的染色溶液将用 PBS 配制。首先，我将把5 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）转移到一根试管中。这是一种生理盐水溶液。接下来，我将每毫升加入0.5 μL的钙黄绿素。现在我向试管中加入 2.5 µL 的钙氨（calcium am）和每毫升 PBS 中含 2 µL 的 athe 同源二聚体。这是 btex 仪器，它可使细胞和培养基在整个体积中均匀分布。现在将200微升细胞加载到此处的七孔板中。然后盖上盖子，确保紧密密封。像这样打开阀门，压力灯亮起，空气进入，然后调节皮带，从而改变压力。因此我进行调整。压力为 5 PSI，管路内部压力也为 5 PSI。从这里到那里，它通过孔内的结构相连。因此，我们只需在此处打开钟罩，然后以5 PSI的压力向细胞注入气体并开始开启，随后Sona阀开始运行。然后我们滚动基底。这个基底只是一块普通的载玻片。接着加入适量样品，并用一些胶带将基底固定住，像这样，对吧？然后，我只需将其固定即可。因此，在移动并开始工作时，我们将整个细胞、进样阀和底物一并设置好。待所有部件安装完毕后，再打开进样阀开始运行。然后我们就这样移动载物台，对吧？接着在基底上形成一些图案，基底上的图案和字符就出来了。接下来，我将把这些打印好的液滴浸入之前配制的染料溶液中。现在将液滴孵育10分钟，然后进行成像。首先，我将通过目镜调整图像。我们的第一张图像是明场图像。我将关闭光源并更换滤光片，以使用蓝色激发光，从而显示绿色荧光。我们将拍摄的第三张图像是死细胞，即Thm Homodimer染色。使用绿色激发光时，我们将获得红色荧光。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过飞沫标题细胞封装

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

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高通量单细胞与多细胞微封装

本视频演示了一种对包埋在三维水凝胶中的细胞进行免疫染色的技术。含有神经前体细胞的水凝胶培养物经固定、通透化处理，并用封闭液处理以防止非特异性免疫染色。加入针对特定蛋白的一抗混合物，随后加入荧光标记的二抗和细胞核染料。最后将样品封片并置于共聚焦显微镜下观察。...

三维水凝胶系统中包封细胞的免疫染色

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本文介绍了一种利用移液器吸头将稀有细胞群体接种至液滴微流控装置的实验方案，以提高细胞在液滴中的包封效率。...

一种基于移液枪头的细胞接种至液滴微流控平台的方法

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本初学者指南介绍了一种通过液滴转移法制备巨大单层囊泡（GUVs）的通用实验方案，讨论了其中的关键步骤，并提供了相关见解，以帮助针对不同应用（包括合成生物学和微机器人技术）进行可能的调整。...

使用液滴转移法制备巨型单层囊泡的可靠方法

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液滴包封细胞

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