小鼠视网膜外植体中神经元树突动态的延时共聚焦成像

从一只活体出生后小鼠的视网膜外植体开始，将其置于膜滤器上，并放入共聚焦显微镜下的培养室中。

视网膜被转染以在星形细胞无长突中间神经元的细胞膜中表达荧光蛋白。

将预先润湿的样品重物置于视网膜上以固定组织。

用缓冲液填充室腔。

保持腔室中缓冲液的流动和温度处于最佳状态，以维持神经元的活性。

将水浸物镜置于成像室中。

开始落射荧光成像。

通过物镜定向的激光激发了无长突细胞中荧光蛋白的发光。

发射的荧光通过同一物镜被捕获，从而实现标记的无长突细胞的可视化。

选择一个荧光强烈的细胞进行成像。

设置成像参数。

通过多个Z平面捕获图像，以实现完整树突形态的三维可视化。

进行延时成像以随时间追踪树突形态的变化。

组装活体成像培养室，并加入充氧的人工脑脊液（aCSF）。打开泵和温度控制器，确保温度不超过34摄氏度。培养室温度可能需要长达一小时才能稳定。建议在开始视网膜解剖前先设置好培养室。稳定的培养室温度有助于减少样本漂移。

将视网膜平铺样本转移至灌流室时，先停止泵的运行，并移除灌流室中的aCSF。随后，将带有视网膜平铺样本的MCE膜放入孵育室中。预先润湿样品压片以消除表面张力，然后将其放置在平铺样本上，确保压片落在MCE膜上以减少样本漂移。重新向灌流室中加入预热的aCSF，并以约1毫升/分钟的速度循环灌流aCSF。

将25倍水浸物镜移至成像腔内。利用落射荧光光源观察标记的感兴趣细胞，并调节成像范围以捕获感兴趣的树突结构特征。

使用识别过饱和和欠饱和像素的查找表，调节激光功率，确保没有任何像素过饱和。采集三维成像体积，并以所需的帧率重复采集。可在每个时间点之间调整成像体积，以补偿样品漂移。